Taq-DNA聚合酶03l石蜡油1滴原理.ppt

* * 医学遗传学实验 遗传病基因突变分析（SSCP） 聚合酶链反应加样（DMD） 3. 人类染色体Ｇ带标本制备及观察 实验内容 遗传病基因突变分析 DNA变性(denaturation) 10?l PCR产物 冰水浴中骤冷10分钟 混匀后，100?C沸水中加热变性10分钟 加样（取10 ?l ） 电泳(140V,~2hr) 银染,约30分钟 10 ?l loading buffer （95%甲酰胺） 1.5ml离心管 遗传病基因突变分析 2、聚合酶链反应加样（DMD） 双蒸水 17.8 ?l 10xBuffer 2.5 ?l MgCl2 2 ?l dNTPs 0.5 ?l Primer R+F (混合) 1.4 ?l DNA 模板 0.5 ?l (正常/病人) Taq-DNA聚合酶 0.3 ?l 石蜡油 1滴 实验原理: 1）DNA抽提 2）聚合酶链反应 3）单链构象多态性分析 遗传病基因突变分析 1）DNA抽提 核基因组DNA可以从任何有核细胞中提出 Agarose gel electrophoresis 双蒸水 10*Buffer MgCl2 dNTPs（ATP/CTP/GTP/TTP） Primer（引物 ）R + F DNA 模板 Taq-DNA聚合酶 石蜡油 PCR 组分 2）聚合酶链反应 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外由引物介导的特定DNA序列的扩增方法. Step 1 (1个循环) 94?C 5分钟 Step 2 (30个循环) 94?C 30秒 59?C 30秒 72?C 30秒 Step 3 (1个循环) 72?C 5分钟 3）单链构象多态性分析 单链构象多态性 Widetype-DNA mutane-DNA heterozygote mutant-DNA homozygote Trp(色氨酸)→Arg(精氨酸) 颗粒状角膜营养不良 实验准备： 实验材料:人外周静脉血 实验器材 :PCR仪等 主要试剂 : DNA抽提 PCR操作 SSCP实验 实验步骤： 双甲基丙烯酰胺（ methylene-bisacylamide，Bis) 单体丙烯酰胺（acrylamide，Acr） TEMED ：四甲基乙二胺，可以催化过硫酸铵产生自由基， 从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合 10%APS： （过硫酸胺）催化剂 H2O 丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶 组分 SSCP实验 夹心垂直板电泳槽示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统 *