实验一分子荧光光谱法.pptVIP

1、光源 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽 荧光计中，常使用卤钨灯作光源 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯 利用汞蒸气放电发光的 光源；常用其发射365 nm、 405 nm、 436 nm 三条谱线 以365 nm 的谱线最强 应用最广泛的一种光 源，可发射250~800nm 很强的连续光源 2、单色器 荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱 大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱 第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长? ex ，用此激发光激发液池内的荧光物质 ? ex 第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长? em。 在选定的? em 下测定荧光强度，定量分析 3、样品池 盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边 4、检测器 把光信号转化成电信号, 放大, 直接转成荧光强度 荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可 大大提高荧光强度 5、读出装置 记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱 （二）激发光谱和荧光光谱 荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱 I ? ex 固定?em 荧光波长 获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的?em不变，改变第一单色器波长，从200~700 nm 扫描，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以I 为纵坐标， ?ex为横坐标得左图，即荧光物质的激发光谱 从曲线上找出?ex，实际上选波长较长的高波长峰 I ? em 固定? ex 激发光波长 获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的?ex不变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以I 为纵坐标， ?em为横坐标得左图，即荧光物质的发射光谱 从曲线上找出最大的 ?em 从图中看出 ?磷＞ ?荧＞ ?激 图 吸收峰 荧光峰 磷光峰 六、 荧光分析及应用 （一）定量分析方法 定量分析依据 If = KC 1. 标准曲线法——最常用的定量分析方法 将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。 以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标 浓度 C1 C2 C3 C4 C5 Cx 荧光强度 If1 If2 If3 If4 If5 Ifx If Ifx Cx C 2. 荧光猝灭法 把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性 若荧光物质 M 与猝灭剂 Q 生成不发荧光的基态配合物MQ M + Q = MQ（非荧光物质） 经推导得出： 猝灭剂加入前 的荧光强度 猝灭剂加入后试 液的荧光强度 常数 猝灭剂浓度 I前/I后与C（Q）有线性关系，可求猝灭剂含量 与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分别加入一系列不同量的猝灭剂 Q ，配成一个荧光物质—猝灭剂体系，然后在相同条件下测定它们的荧光强度，得一曲线 取相同荧光物质 CM CM CM CM … CM 加不同量Q CQ0 CQ1 CQ2 CQ3 … CQx (CQ0 =0) 测 If I前 I后1 I后2 I后3 … I后 x 计算 I前/I后 I前/I后1 I前/I后2 I前/I后3 … I前/I后x I前/I后x CQx CQ I前/I后 3. 多组分混合物的荧光分析 (1) 如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定 可分别在各自的?荧波长处测定,求出它们的含量 (2) 如果两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有显著区别,在某一激发光下一个组分产生荧光峰,另一组分不产生荧光; 可选用不同的激发光进行测定 Al3+—8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液 ? ex =365nm ? em=520nm Ga3+—8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液