WesternBlot原理蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后.ppt

9. 聚胶时间：虽然应用过硫酸铵／TEMED催化后灌胶15~20 min即可观察到凝胶的形成，但至少需90 min才能保证95％以上的单链聚合成长短以及具有合适的孔径大小。采用核黄素时聚胶时间需更长，但它一般用于等电聚焦即根据蛋白质的电荷性质进行分离，对孔径大小要求不高，因此不必等很长时间(完全聚合需8 h)。 　10. 单体的浓度：是指单体总重量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(w／v)，可选择的范围为3％~30％，单体浓度增加后聚合速度将加快，因此可适当减少催化剂的用量。 11. SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4g SDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。 12. 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS测定分子量有10％误差，不可完全信任。 13. 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。 14. 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。 常见问题及处理办法 １．纹理和拖尾现象 　 由于样品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素。 　２．蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量。 　 ３．电泳时间比正常要长 　可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的pH选择错误。 ４．指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形）：说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率。 5.凝胶时间不对． 通常胶在30min内凝聚．如果凝聚得太慢，可能是TEMED，APS剂不够或者失效． 6.出现“皱眉”（两边向下中间鼓起） 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 7.出现“鬼带” 如何处理？ “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。 8.为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。 SDS的优点 设备简单 快速 分辨率和灵敏度高 特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和分子量的测定 SDS的缺点 1. 有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的（如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他们在变性剂和强还原剂的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类的蛋白质，SDS测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整蛋白质的分子量。 SDS的缺点 2. 还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质（如组蛋白F1），含有较大辅基的糖蛋白和含有二硫键较多的蛋白质，以及一些结构蛋白（如胶原蛋白）等，它们在SDS-凝胶系统中，电泳的迁移率与分子量的对数不呈线性关系。因此，为了测得真实和完整的蛋白质分子量，通常可采用多种方法进行测定和相互验证。  小技巧 1： 电泳缓冲液的使用： 电泳缓冲液是完全可以回收再用的，但前提是每次的内层缓冲液必须是新配的。每次在电泳完成后内外层缓冲液一起回收到一个瓶里，作为下次的外层缓冲液使用。就是配制新的缓冲液只作为内层使用（配制1L可以用很久的），每次都用回收的缓冲液作外层，效果一点都不差，即节省了试剂，又节省了时间。 2： 电泳条件的选则 电泳不采用先低压再高压的常用方法，每次都是上样后直接采用200V恒压电泳，一般Bio－Rad的胶板，39min即可跑到头，电泳结果一点都没有影响。电压和电流的选择的标准是发热不足以影响到电泳的进行。 3： 染色与脱色 分子克隆上介绍的方法耗时太长，现在用Crystal的方法已经相当快了，稍做改动：染色时加入染液后，在微波炉中煮沸一次即可，