使用实时定量PCR技术验证cDNA和差异显示PCR技术.docVIP

PAGE PAGE 1 实时荧光聚合酶链反应结合融解曲线分析在α-地中海贫血基因诊断中的价值 刘敬忠 闰梅 王立荣 王战勇 周艳 肖白 　　【摘要】目的 建立自动化、高通量、准确快速检测缺失型α-地中海贫血基因型的技术。方法运用SYBR-Green1和ABI 7000热循环仪分别进行3个实时荧光定量聚合酶链反应（SYBR-Q-PCR），同时进行融解曲线（D.C）和Tm值分析,根据特定Tm值对应的D.C峰值判定基因型,即以该峰值≥Cut off值定为PCR结果阳发性,将PCR产物重组到T-载体,筛选到含正确扩增片段的克隆,以梯度稀释重组质粒DNA为模板,进行SYBR-Q-PCR得出标准曲线,从而定量未知标本.结果 优化了3个SYBR-Q-PCR反应的引物及其浓度,热循环条件等.检测—SEA等位基因的PCR产物长800bp,Tm=82.5℃±1℃.重组质粒拷贝数在1至105范围内,其对数值与CT值均呈良好线性关系.该检测技术的灵敏度常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳法高出16倍以上,联合运用3个SYBR-Q-PCR反应可以为—SEA缺失携带者,缺失型HbH病,非缺失型Hb病、α-地贫2纯合子、Bart′s水肿胎儿综合征做出基因诊断，并可用于产前诊断。结论? 该技术具有自动化程度高、不需荧光标记探针、成本低，易质控、防污染、高通量等优点，适于临床推广应用。 Mylab? qPCR SmartMix 非常方便的荧光定量检测试剂。 『规格』1ml/管。 『特点』 本产品是非常方便的荧光定量检测试剂，以2×qPCR Mix的形式提供，已混合了Taq DNA聚合酶、酶抗体、dNTP、PCR Buffer、SYBR Green I、稳定剂和增强剂等试剂，只需加入模板、引物即可进行定量PCR反应。SYBR Green染料与双链DNA结合，在激发光的作用下发出荧光，通过荧光强度的测定，即可确定双链DNA的含量。整个过程非常简单，最大限度的减少加样次数，有效避免加样误差及交叉污染。特异性的酶抗体低温下可封闭Taq酶活性，从而获得HotStart功能，极大地提高了PCR反应的特异性。不用繁琐的条件摸索，同样可以获得精确度好、重复性高的定量PCR反应。 『保存条件』-20℃避光保存， 『有效期』12个月。 『适用范围』 单个基因的PCR扩增及其荧光定量检测。 『使用方法』 使用时只需取适量2′ qPCR SmartMix溶液，加入引物和模板，并加入去离子水补足体积，使qPCR SmartMix溶液的浓度为1′ 即可进行反应。反应中实时采集荧光信号，PCR反应完成后，进行融解曲线分析。 『反应举例』 注意：以下举例多数情况下可参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据实际情况，设定最加反应条件。 用2′ PCR TaqMix产品，以人基因组DNA 为模板，扩增0.5kb的片段，反应体系为25ml。如反应体系不同，可按此比例增加或减少用量。 1.??????? 将2×qPCR SmartMix、模板DNA、引物以及去离子水在室温融化后混匀。 2.??????? 准备PCR反应混合物。冰浴中按下面的量加入各种反应物，混匀： 2′qPCR SmartMix 12.5ml Primer 1 (5mM) 1.25ml Primer 2 (5mM) 1.25ml Template 0.5mg ddH2O 补至25ml 3.??????? 按照下表所示，设置PCR扩增程序。 首次扩增某一模板时，一般先在延伸步骤采集数据，PCR反应完成后，进行融解曲线分析（见步骤5）。以后扩增相同的模板时，可以根据融解曲线分析结果加入数据采集步骤（详见步骤6），以便获得更准确的定量结果。 步 骤 时 间 温 度 说 明 PCR起始激活步骤 10 min 95°C 激活Taq DNA聚合酶 3步或4步循环 变 性 15 sec 94°C 　 退 火 30 sec 50-60°C 比引物的 Tm值大约低5-8°C。 延 伸 30 sec 72°C 如果未加入附加的数据获取步骤，则在这一步获取荧光数据。 可选：数据获取 15 sec D °C 引物Tm D 产物Tm 循环数 35~40个循环 循环数与模板DNA的量相关 5.??????? 进行PCR产物融解曲线的分析。 ??? 强烈推荐进行融解曲线分析，以验证PCR产物的特异性。融解曲线分析是定量PCR仪配套软件中的分析步骤。请根据仪器供应商的介绍进行操作。一般而言，应当在65°C~95°C之间获取融解曲线数据。 引物二聚体的形成与引物设计及模板的