高级生物化学的教学安排.docVIP

PAGE PAGE 2 高级生物化学实验 Advanced Biochemistry Experiments 昆明医学院基础医学院生物化学教研室 Department of Biochemistry, Faculty of Basic Medicine, Kunming 二OO七年九月 《高级生物化学实验》（Advanced Biochemistry Experiments） 63学时，是《生物化学》理论教学的深化和补充。内容涉及生化基本技术，包括分离、层析、电泳和分光分析技术；酶动力学参数测定方法；同时结合基因重组及其表达蛋白的分离鉴定等较为实用的技术和方法。要求学生掌握等电聚焦电泳及蛋白质等电点的测定、薄层层析鉴定小分子有机化合物的原理及其定性和半定量的方法、Km值和Vm值的测定方法及细胞内酶（如G6PD和LDH 等）的比活性测定的方法；熟悉肝细胞核分离及细胞器纯度的鉴定、与免疫印迹相关的原理和方法（SDS-PAG和转膜技术）以及基本仪器（高速离心机、可见紫外分光光度仪等）的使用；了解酶促反应动力学的基本影响因素及其机理、重组表达蛋白样品制备的基本方法。 考核方式以开卷和平时成绩综合评价（开卷：平时分＝40%：60%）。开卷重点考核对实验相关的基本理论、技术应用的掌握情况；平时成绩着重考查学生的基本操作、实验结果的准确度和精密度、灵活运用所学知识分析和解决问题的能力。 主要参考书目： 1. 王重庆，李云兰主编：《高级生物化学实验教程》， 北京大学出版社，2001年7月第一版 2. 张龙翔,吴国利主编：《高级生物化学实验选编》，高等教育出版社，1989年9月第一版3. 陈毓荃主编：《生物化学实验方法和技术》，科学出版社，2002年8月第一版 4.《分了克隆实验指南》第二版[美] J. 萨姆布鲁克 等著，金冬雁 黎盂枫 等译，科学出版社，1992年3月第一版 5. 可找到相关理论及其应用，图文并茂，有益学习。 目 录 实验一　pThioHis(A)-G6PD表达质粒DNA的提取及其酶切鉴定 4 实验二　血红蛋白等电聚焦分离及其等电点测定 8 实验三　G6PD重组酶的诱导表达及总蛋白测定 11 实验四　小鼠肝细胞核的分离纯化 14 实验五　G6PD 重组酶的分离及其活性测定 17 实验六　乳酸脱氢酶同工酶的测定 21 实验七　G6PD 重组酶动力学测定 24 实验八　糖的硅胶G薄层层析分析鉴定 29 实验一 pThioHis(A)-G6PD表达质粒DNA的提取及其酶切鉴定 Isolation of pThioHis(A)-G6PD Expression Plasmid DNA and Identification by Restriction Digestion 一、目的： 掌握质粒DNA提取的基本原理和方法；熟悉限制性核酸内切酶在基因工程中的应用和切除质粒的方法；熟悉琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；了解原核表达载体的构建和表达系统的选择。 二、原理： 质粒（plasmid）是一种染色体外的能自主复制的双链、闭合及环状的DNA分子。其分子大小在1－200kb之间。质粒广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，在某些动、植物细胞中也有存在。质粒一般独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞某些表型。 质粒DNA的分离包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。 提取的质粒DNA可以有三种构型：超螺旋、开环和线性。 共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）即以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的DNA分子叫作开环DNA（open circular DNA, 简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒的cccDNA因其结构最为紧密，迁移率也最大，跑在最前面；其次为线性构型的质粒，开环构型的质粒跑在最后。 限制性内切酶是分子生物学研