临床样本的采集运输和保存及核酸提取.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * 表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法： 每mg组织中加入1mlTrizol试剂，高速破碎组织（使用高速组织捣碎器） 加入氯仿0.2ml,轻轻颠倒混匀，室温静置分层。 高速离心12000rpm，4-8 °C ，10分钟 吸上清液至新离心管中，约600ul 加入500ul异丙醇，混匀，室温静置10分钟 高速离心12000rpm，4-8 °C ，10分钟 弃上清液，沉淀为RNA 加入1mlDEPC处理的75%乙醇，混匀，7500rpm离心， 4-8°C，5分钟 加入DEPC处理水30ul，混匀，55-60 °C水浴 3ul加入297ulDEPC水，测定浓度和纯度 异硫氰酸胍（GuSCN）结合氯仿-酚提取法 试剂的作用： 加入β-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活 （四）、mRNA的分离纯化 除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3′末端带有长短不同的poly（A）尾巴 利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * （一）、DNA样品准备 常见的标本： 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织： 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 － 70℃或液氮 DNA提取前样本采集、预处理和保存： 全血 抗凝剂： EDTA-Na2 或枸橼酸钠 作为抗凝剂 不宜使用肝素 抗凝剂处理血 肝素 柠檬酸* EDTA* -80℃ 保存2个月，第10天收率90% 4 ℃ 第四天收率90% 第10天提取效果差 第十天收率85% 室温 提取效果差 第四天收率90% 第十天提取效果差 （二）、DNA提取 （一）酚抽提法： 先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100－150kb。 酚 抽 提 法 提 取 步 骤： DNA酚抽提法示意图 主要试剂的作用： EDTA：1. 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2. 降低细胞膜的稳定性 SDS的作用： 1. 溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂 2. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来 3. 对RNA、DNA酶有抑制作用 4. 与蛋白质形成R-O-SO3 ….R蛋白质复合物，使蛋白质变性 蛋白酶K： 水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质 蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可 同时使用 苯酚： 蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性 苯酚溶于有机溶剂，微溶于水 提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率 氧化苯酚会破坏DNA DNA的沉淀： 1）无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。 无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。 2）异丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分子 （二） 甲酰胺解聚法： 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右。 （三）磁珠法： 磁珠在高盐低pH值下吸附核酸，在低盐高pH值下与核酸分离，再通过移动磁珠来获取DNA （四）微柱法 ： 利用DNA在高盐、低pH的特定溶液环境下可吸附在固相介质（如硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE中 （三）、DNA的浓缩 固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋 外敷PEG至合适量 丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积 （四）、DNA回收 主要是从电泳中分离回收DNA片段 回收原则：尽量提高回收率 去除回收DNA样品中的污染物 DNA降解的原因 样本不够新鲜，采集材料过陈旧 样本本身存在大量DNA酶 提取DNA的生物活性差的原因？ 提取的基因组DNA盐浓度过高 基