分子检测标本处理及核酸提取技术要点.ppt

* * * * * 对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。 * * * * 降解 新鲜细胞或组织： 裂解液的质量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足 组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。 建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 冷冻样品： 样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点； 先用液氮研磨，再加裂解液匀浆； 样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。 OD260 /OD280 比值偏低 蛋白质污染： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 抽提试剂残留： 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。 解决办法:再沉淀一次后，溶解。 用水稀释样品： 测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。 * 蛋白质污染： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 * 　 * * * 在核酸提取中，应至少带有1份已知弱阳性质控样本。其最后的检测结果，应是核酸提取和扩增检测有效性的综合反映。同时，还应至少带一份已知阴性质控样本，扩增测定的结果可以判断核酸提取过程中是否发生污染。 * DNA的提取方法 经典方法： “酚-氯仿提取法” 核酸提取的改良方法： --旋转离心柱（SPIN COLUMN）方法 --玻璃粉吸附法 --二氧化硅或硅藻吸附法 --微量全血核酸提取法 其它方法： --疏水性Immobilon-P膜 --全自动核酸纯化仪 核酸提取方法的选择 血液 细胞学 新鲜组织 石蜡标本 ----可分别用专门的试剂盒 提取过程中的注意事项 去除干净杂质 DNA释放出来后手法要轻柔 纯化的靶核酸的完整性可使用凝胶电泳观察。 核酸提取结果 产率：可用核酸定量仪读数测定 DNA：可溶于TE溶液中 RNA：可溶于无RNase的纯水 浓度：100ng/μl，总量20~40 μg或以上 纯度：可通过提取物A260/A280比率判定： DNA的比值为 1.8 RNA的比值为 2.0 标本的类型 标本的正确取材及保存 核酸的提取方法及质控标准 常见问题及对策 质量控制及防污染措施 样品中含有杂质 标本量太大，消化液不能充分消化杂质 操作不规范 适当减少标本量 严格按规则操作 核酸提取常见问题 问题一：样品不纯，抑制后续PCR反应。 原因 对 策 标本室温放置过久或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 RNA保存时间过长 反复冻融 尽快取材，或低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 RNA提取出来后马上反转录 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融 问题二：降解。 对 策 原因 实验材料不佳或量少 裂解不充分 足够量的标本 冰冻组织匀浆研磨充分；裂解时，时间适当延长（也可增加PK的用量） 问题三：提取量少。 对 策 原因 临床检测试剂必须为CFDA批准的试剂，或具有严格标准操作规程（SOP）的自配试剂（LDT）。 所采用的测定方法特异性好，灵敏度、准确度、精密度符合国家卫生计生委临床检验中心、IFCC、WHO等推荐的方法性能。 标本的类型 标本的正确取材及保存 核酸的提取方法及质控标准 常见问题及对策 质量控制及防污染措施 核酸提取的质量 纯化的靶核酸的完整性 核酸提取的产率 核酸纯度 核酸扩增质量控制 临床PCR检测方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、准确性，尽量降低假阳性、假阴性和非特异性扩增。临床样本扩增时，会出现假阳性和假阴性，导致检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。 污染原因 标本间交叉污染 PCR试剂的污染 PC