人胰岛素瘤组织基因表达谱地初步研究.pdf

{现语一阮辩凡学坝1‘城究生学位论曼 三、cf)Na文库的构建 01 mini 用mRNAigoTex PCR cDNA文库构建试剂盒(C10ntech)构建。 口q、DNA模板的制备及自动测序 PlasmidKit 从LB平板一h随机挑选阳性克隆，培养过夜，用R．E．A．LPrep96 (Qiagen，ChatsworthCA)抽提双链DNA模板，并用凝胶电泳鉴定质粒的质和量。 核糖核酸(Dye termi／late)的测序试剂盒(PE)，在9700PCR仪(PE)上进行荧光引物 指导下的延伸反应。用377DNA自动测序仪(PE)进行测序。 扛、数据收集和分析 用Fetch 3．0软件将所有数据传递到工作站(SUN)，序列分析采用GCG软件包 (Geaetic Version veFsitvof Computer 9．0)。首先经Phred—Phrap软件(Unj Washi ch软件(Lw) 去除载体序列、线粒体DNA及Alu、L1等重复序列，序列中不确定碱基(N)的百分 以±：、重叠长度大于lOObp者即代表该基因，归入已知基因；与已知基因同源性 比较低或无同源性的片段，而与dbEST比较达上述标准的序列归入归入已知Es风： 达不到上述标准的序列归入新ESTs。 序列命名由8个字符组成，其应包括4层信息：即组织、文库、96孔板及克 隆以别号。例如BCAAAA01指胰岛素瘤A文库，AA96孔板上的101克隆。 六、基因功能分类 根据同源基因的功自PA,g已知基因分为8类：G1代表内分泌相关基因，包括激 素和分泌蛋白；参与激素合成、分泌和转运的基因；内分泌组织特异表达的基因。 G2代表细胞周期相关基因，包括参与细胞增殖、分化和调亡的基因。G3代表信号 转导楣关基因。G4代表细胞／运动相关基因。G5代表机体／细胞防御相关基因。G6 代表基因／蛋白表达相关基因。G7代表／能量代谢相关基因。G8代表未知功能基因。 此外，我们还将其它组织特异表达的、又在我们的文库中出现的基因单独列出。 基因表达丰度用文库中与该基因匹配的ESTs拷贝数表示。 警赣嵩端型墼L———～—～～一 用半定量RT—PCR方法同征常胰腺组织比较验证文库中高表达的基因。RT～PcR svnthesls for systemR，i—PCR，GfBCO／BRL)。其操作步骤简述如下： RNA 1u1 01igoDTIul DEPC处理水10u1 混匀后70 9C水浴10分钟 置于冰上，短离一心后加入 5一Fi rst band Suffer 4u1 0．】MDTT 2uI dNTP hl 混匀后42℃水浴2分钟 Ir