病原生物学专业优秀论文 人腺病毒的分离鉴定和松针油抗腺病毒作用机制研究.doc

【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 病原生物学专业优秀论文 人腺病毒的分离鉴定和松针油抗腺病毒作用机制研究 关键词：腺病毒 培养鉴定 序列比对鉴定 抗病毒活性 松针油 克隆测序 摘要：腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，人腺病毒有六组51个血清型，能引起人不同器官的多种疾病。在正常人群中，腺病毒感染能引起呼吸道疾病、结膜炎、胃肠炎、出血性膀胱炎，个别可发生肝炎、心肌炎、脑膜炎、肾炎等。在骨髓移植患儿中，由腺病毒诱发的死亡率高达50-80％。目前尚无有效的抗腺病毒治疗药物，因而开展防治腺病毒感染的研究具有重要的意义。为了解哈尔滨地区腺病毒的流行状况，开展有关腺病毒感染流行病学、病原学等研究，以及为建立合适的防治策略，本文收集了哈尔滨地区儿童呼吸道感染患者的咽拭子标本(2005年11月到2006年3月)，对其进行了病毒的分离鉴定，并对松针油及其单体的抗腺病毒作用的机理进行了研究。 将临床采集的咽拭子标本接种于HeLa细胞进行病毒分离培养，对致细胞病变阳性的标本用腺病毒属特异性引物进行PCR扩增腺病毒核酸，初步鉴定病毒种类。进而，用超薄切片透射电镜观察病毒形态、免疫荧光方法检测病毒抗原，以及对PCR产物进行克隆测序和序列比对鉴定。病毒分离鉴定实验结果表明： (1)对32例标本进行细胞培养分离病毒，有14例(43.7％)标本接种后出现细胞病变。(2)用腺病毒特异性通用引物进行特异性PCR扩增，结果有1例(57号标本)CPE阳性细胞标本出现了预期扩增条带。(3)电镜结果显示该例PCR扩增阳性标本中有晶格状排列的腺病毒样颗粒。 (4)用腺病毒六邻体单克隆抗体，对该例PCR扩增阳性细胞中的病毒抗原进行检测，结果发现细胞标本中均有清晰的荧光标记信号存在：同时中和试验结果表明腺病毒六邻体抗体可中和57号标本的病毒，中和抗体效价为1：1024。 (5)将PCR阳性产物克隆到pQE31载体上进行序列测定，并与GetaBank发表的序列相比较，发现该标本与腺病毒7型最为接近，六邻体核苷酸同源性为99.2％，氨基酸同源性为99.3％。 为开发抗腺病毒药物，本文用水蒸气蒸馏法提取松针油，气相色谱一质谱联用仪分析松针油成分，选出松针油中含量丰富的单体进行抗病毒机理研究。采用细胞病变抑制实验和噻唑蓝(MTT)比色法观察松针油及单体α-蒎烯、β-蒎烯和柠檬烯对人腺病毒3型的抑制作用。同时利用原子力显微镜观察病毒与药物直接作用后病毒形态学的改变：用激光共聚焦显微镜检测药物在吸附阶段对病毒的作用效果。松针油抗腺病毒实验结果如下： (1)MTT结果显示松针油、β-蒎烯和柠檬烯抗腺病毒的作用方式主要为对病毒的直接灭活作用、在病毒的吸附阶段抑制病毒吸附以及在病毒的生物合成阶段抑制病毒的复制。但这三种药物均对细胞无保护作用，不能阻断病毒进入细胞。(2)α-蒎烯对病毒的抑制作用主要表现在对病毒的直接灭活作用和对细胞的保护作用，从而阻挡病毒进入细胞。 (3)原子力显微镜观察结果显示松针油及单体对ADV3发挥直接灭活作用时，可以破坏病毒的结构，表现为病毒体积变小，表面不光滑，形态不规则，从而进一步证明药物在直接灭活方式上对病毒的抑制作用。 (4)激光共聚焦结果进一步证明松针油、β-蒎烯和柠檬烯在吸附阶段对病毒有抑制作用，而α-蒎烯无作用。综上所述，在32例呼吸道发热儿童标本中分离出一株人腺病毒，此分离株为腺病毒B组7型腺病毒。松针油及单体有抗腺病毒作用，松针油和单体β-蒎烯、柠檬烯抗腺病毒的作用方式主要是对病毒的直接灭活作用、抑制病毒作用以及抑制病毒复制作用等，但却对细胞无保护作用。α-蒎烯对病毒的抑制作用主要表现在对病毒的直接灭活作用和对细胞的保护作用。本次研究结果为研发天然、高效、低毒的抗腺病毒的药物提供了科学依据，为植物药的开发和利用，促进我国经济植物的研究与利用提供了新的思路。 正文内容 腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，人腺病毒有六组51个血清型，能引起人不同器官的多种疾病。在正常人群中，腺病毒感染能引起呼吸道疾病、结膜炎、胃肠炎、出血性膀胱炎，个别可发生肝炎、心肌炎、脑膜炎、肾炎等。在骨髓移植患儿中，由腺病毒诱发的死亡率高达50-80％。目前尚无有效的抗腺病毒治疗药物，因而开展防治腺病毒感染的研究具有重要的意义。为了解哈尔滨地区腺病毒的流行状况，开展有关腺病毒感染流行病学、病原学等研究，以及为建立合适的防治策略，本文收集了哈尔滨地区儿童呼吸道感染患者的咽拭子标本(2005年11月到2006年3月)，对其进行了病毒的分离鉴定，并对松针油及其单体的抗腺病毒作用的机理进行了研究。 将临床采集的咽拭子标本接种于HeLa细胞进行病毒分离培养，对致细胞病变阳性的标本用腺病毒属特异性引物进行PCR扩增腺病毒核酸，初步鉴