鼠疫耶尔森氏菌在小鼠巨噬细胞上的受体——Murine+SIGN-R1.pdfVIP

鼠疫耶尔森氏菌在小鼠巨噬细胞 S王GN—Rl 上的受体～一Muri魏e 硕士研究生： 张树声 指导教师： 李芳教授 专业名称： 免疫学专业 摘 要 目的：鼠疫耶尔森氏菌是一类引起人与动物鼠疫的革兰氏阴性菌，其 自然宿主是啮齿类动物。它能够利用抗原呈递细胞(抗原presenting cells， APCs)的捕获，转移到淋巴结，弓|起淋巴结鼠疫。但是APCs 最初如何捕捉鼠疫菌仍然未知。由于近来发现的C型凝集素受体与某些 革兰氏阴性茵的核心脂多糖(核心LPS)有作用。因此，我们推测鼠疫 菌也是通过某种C型凝集素进入到APCs的，例如臣噬细胞。本次实验 将对这个机制加以验证，著找到相应的配体和受体。 方法：l通过转染，建立稳定表达小鼠C型凝集素受体的细胞株。含有5 间G418筛选，找到能稳定表达的单克隆株，并用流式细胞仪检测。 2构建鼠疫菌的光滑型和深度粗糙型。野生鼠疫菌是粗糙型，核心 脂多糖暴露在最外面。用自杀质粒同源重组的方法缺失编码核心脂多糖 起始位的糖基转移酶，将阻断核心脂多糖的表达，得到鼠疫菌深度粗糙 型。在核心脂多糖外侧表达O．抗原将得到光滑型。 xl 05／ml铺在 3粘黠和侵袭实验细胞悬浮于含2％FBS的RPMI，以4 xl07CFU／ml的细菌。在 96或24孔平板中。按照l：50体积加入浓度为l 将裂解液稀释后涂在乎板上，得到粘附和侵袭细菌的总量。 溺庆大霉素处理细菌和纲脆混合液，能够杀死细胞外的纲菌悉不透 00 过宿主细胞膜，得到的是侵入细菌的数量。l ug／ml的庆大霉素作用l 小时席洗去抗生素，裂解细胞进行涂菌计数。细菌侵袭的程度以细胞裂 解液中细菌的CFU来估算。所有的实验薰复3次。 4流式细胞仪检测细菌的侵袭能力。细燕在荧光试剂CFDA．SE审染 色，洗去多余的染色液后，把标定好的细菌加入到细跑中培养2小时。 细胞液经过洗涤除去未结合的细蔺后，用2％的多聚甲醚固定。在做流式 细胞仪检测前，以l：l blue(O．4％)混匀t室温l0分钟以 0加入Trypan blue能阻止荧光僵不能透过细胞膜。被 淬灭缨胞辨缨菌的荧光。Trypan 摄取细菌的比例以细胞发出的荧光强度来判定，强度越高，细菌被吞噬 的程度越高。 5外源物质抑制安验加入辨源物质包括抗体，甘蘑糖，低聚糖，歇 等来封阻细胞的吞噬作用，验证细菌和细胞相互作用的特异性。 6体内吞噬实验向活体小鼠腹腔注射细菌悬液，1．5小时后处死小 鼠，提纯腹腔巨噬细胞后按照体外侵袭实验方法进行。 结果；鼠疫萤野生型较光淆型和深度粗糙型在体内外具有更赢豹侵 胞中，只有CHO—SIGN-Rl获得了吞噬鼠疫菌的能力。这种侵袭现象能 够被SlGN．Rl懿抗体所抑制 结论：MurineSIGN．R1是鼠疫耶尔森氏菌在小鼠巨噬细胞上的受体。 其识别机理是野生型鼠疫菌天然暴露核心脂多糖部分，能够被小鼠巨噬 细胞上的SIGN．R1识别。阻断这种识别作用为我们在预防和治疗鼠疫菌 上提供新的愚路。 SIGN-R1 关键词鼠疫耶尔森氏菌DC．SIGN 核心LPSO．抗原 2 Yersiniathat isa