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不同植物样品可溶性蛋白 含量和多肽组分的差异 实验目的 • 掌握冷冻离心机的操作使用方法。 • 掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理。 • 掌握分光光度计的使用方法和原理。 • 掌握可溶性蛋白的定量测定方法和原理。 • 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和基 本操作过程。 实验包括三个部分内容： 一、不同植物样品可溶性蛋白的提取。 二、植物可溶性蛋白含量的测定。 三、聚丙烯凝胶电泳分离可溶性蛋白。 一、不同植物样品可溶性蛋白的提取 • 原理 植物材料中通常含有两类蛋白，一种是易溶 于水主要存在于细胞基质、叶绿体基质和线粒体 等细胞器基质中的可溶性蛋白，另一类是难溶于 水主要存在于各种细胞器膜上的膜结合蛋白。将 植物材料在一定的提取缓冲液和0～4℃低温下充 分研磨，可溶性蛋白将溶解在提取缓冲液里，通 过离心将未破碎细胞器和膜蛋白去除，得到的离 心上清夜就是可溶性蛋白的粗提物。 离心机基本原理 ⒈离心力（centrifugal force，Fc ）离心作用 是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体 都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc ） 2 的大小等于离心加速度ω X与颗粒质量m的乘 积，即： 2 FC ＝m ωX 其中ω是旋转角速度，以弧度/秒为单位；X是 颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位；m是质 量，以克为单位。 ⒉相对离心力（relative centrifugal force，RCF ）由于各种 离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同， 离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数 字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不 同的离心机上获得相同的结果。 RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。 2 －5 RCF ＝F离心力/F重力＝ m ωX/mg=1.118 ×10 . N . X 5 N （rpm ）=RCF ×10 / （1.18 ×X ） 式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力 加速度（980cm/sec2 ）；N为转子每分钟的转数 （rpm ）。 植物细胞破碎后通过差数离心形成的沉淀 沉淀 转速×时间 内含物 A 150g ×20min 完整细胞 B 1000g ×20min 细胞核，细胞碎片 C 3000g ×6min 叶绿体 D 10000g ×20min 线粒体、溶酶体、微体 E 100500g ×20min 微粒体 F 100500g ×20min 核糖体 ＋0.26%脱氧胆酸 实验注意事项： • 整个操作过程在0－4℃低温下进行； • 研磨必须充分； • 加蛋白酶抑止剂（PMSF 苯甲基磺酸氟）或抗 氧化剂； • 提取的蛋白一般需要分装后，在液氮或－80℃低 温下保存。 实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 自选植物材料，至少三种以上处理，例如： 1、不同植物的叶片； 2、同一植物的根、茎、叶、花等不同组织器 官； 3 、同一植物不同发育状态如嫩叶、成熟叶和 老叶； 4、或者叶片用不同的高温处理等等。 （二）试剂 1．提取缓冲液：0.125 mol 的Tris-HCl, pH7.0，称取12.5gTris于烧杯，用适量双蒸 水溶解，HCl调pH至7.0,定容至1000ml。 2 ．聚乙烯吡