2019年ABI7500-Fast-PCR作业指导书.docVIP

1、目的 规范该型号ABI7500Fast荧光定量PCR仪操作程序，正确使用和维护仪器，保证检测工作顺利进行，操作人员人身安全和设备安全。 2、适用范围 适用于ABI7500Fast荧光定量PCR仪的使用操作与维护。 3、职责 3.1 操作人员按照本规程使用仪器，对仪器进行日常维护。 3.2 保管人员负责对仪器进行定期维护、保养。 3.3 科室负责人监督检查本操作程序的执行。 4、操作程序 4.1启动笔记本电脑，进入Windows XP系统。 4.2待电脑桌面图标出现后，打开ABI7500Fast荧光定量PCR仪主机电源。 4.3待主机电源指示灯亮后，双击电脑桌面7500 SDS图标 ，打开软件。 4.4新建文件：在Quick Startup document窗口点击Create New Document按钮，出现New Document Wizard窗口，在Assay菜单中选择Standard Curve（Absolute Quantification），点击Finish按钮后打开一个空白96孔板文件。 4．5探针设置：双击任意一个孔打开Well Inspector窗口。 4．6点击Add Detector按钮，打开Detector Manager窗口，选择Detector List中的探针，例如用的是TaqMan-FAM标记探针，在列表中选择Reporter：FAM，Quencher：TAMRA；如果用的是SYBR Green I，则在列表中选择Reporter：SYBR，Quencher：（none）。选择所需探针，按住Ctrl键可选择多个探针，再点击Add To Plate Document 按钮，最后点击Done按钮关闭Detector Manager窗口。此时Well Inspector窗口仍然是打开的。填样品表：在96孔表中选择有样品的一个或者多个孔，然后在Well Inspector窗口的Sample Name输入样品的名称，在探针列表中的Use项下的方框中打钩选择要用的探针，在Task栏中选择指定样品类型：未知样品选择Unknown，阴性对照选择NTC，标准品选择Standard。对于Standard，还要在Quantity栏中输入对应DNA的拷贝数。注意如果没有输入拷贝数，软件将不能自动生成标准曲线。已设定过的Plate Document显示，同时右下方的Status显示“Connected”。 4．7参比荧光：如果所用的定量PCR试剂含有ROX参比荧光，则在参比荧光栏（Passive Reference）选择ROX；如果所用的定量PCR实际不含有参比荧光，则选择（none）。完成后点击Close按钮关闭Well Inspector窗口。 4．8循环参数：切换到Instrument页面，设定及修改PCR热循环程序。删除：按住Shift 键并在相应的Stage或Step中点击，使该步骤被选中变黑，再按Delete键即可删除。插 入：在需要插入参数的位置点击，出现粗黑竖线后，分别点击Add Hold、Add Cycle或Add Step按钮添加保温、循环或循环中的一个步骤。修改温度和时间：拖动鼠标，选中需要修改的温度或时间数字，输??新的数值即可。Reps栏可输入循环数，Sample Volume(ul)栏输入反应体积。 融解曲线试验：点击Add Dissociation Stage按钮，仪器即在定量PCR循环完成后继续做融解曲线试验。如果是采用SYBR Green I染料方法进行定量研究，建议进行融解曲线试验，以判定PCR反应特异与否。单峰表示单一的PCR扩增产物，多峰表示PCR扩增有杂带。注 意：只有SYBR Green I染料方法才需要进行融解曲线试验，TaqMan探针和MGB探针法都不需要。Run Mode：Standard 7500,模块的升降温速率为2.5℃/sec。Data Collection:选择在退火温度步骤收集荧光信号，以黄色背景显示。 4．9启动扩增：确认96孔板或全部样品管在主机内放置妥当，点Save按钮保存文件设置，保存类型选SDS Documents(*.sds)。点击Start按钮，开始PCR循环。屏幕上动态显示PCR进程和剩余时间。 4．10监控进程: 切换到Results页面的Amplification Plot子页面，可以实时显示PCR曲线随着循环增加而逐步增长的实际情况。如果Detector选FAM或VIC，只显示对应探针的变化情况；如果选All，则同时显示所有探针的反应进程。 4．11保存结果：程序结束后，点Disconnect 按钮，然后File → Save 保存实验结果。 4．12关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭ABI 7500 SDS软件，然后关掉定