J-12,13 实训三 菠萝蛋白酶的制备及活力测定.docVIP

江苏农林职业技术学院讲稿 第 PAGE 1 页 共 NUMPAGES 2 页 PAGE PAGE 1 第十二、三讲 授课内容 实训五　菠萝蛋白酶的制备及活力测定 授课时数 4 教学目标 1、掌握菠萝蛋白酶制备的基本原理和方法；2、菠萝蛋白酶活测定方法 教学重点 菠萝蛋白酶提取方法原理和酶活保护措施 教学难点 单宁沉淀蛋白的酶活保持 教材教具 教学内容（含教学步骤、时间分配、教法学法、作业布置等） 实训五　菠萝蛋白酶的制备及活力测定 一、目的和要求 1、掌握菠萝蛋白酶制备的基本原理和方法；2、掌握菠萝蛋白酶活测定方法。 二、原理 菠萝蛋白酶具有一定的医疗保健功能：1、抑制肿瘤细胞的生长；2、对心血管疾病的防治；3、用于烧伤脱痂；4、消炎作用；5、增进药物吸收。 单宁又称鞣酸、丹宁酸，是多酚中高度聚合的化合物，它们能与蛋白质（酶）形成难溶于水的复合物，是蛋白沉淀剂。本试验即利用单宁沉淀法提取菠萝蛋白酶。 EDTA、Vc和L－半胱氨酸具有保护酶活功能；锌离子、硫代硫酸钠等具有酶活激活的作用。 活性测定方法是以酪蛋白水解释放的酪氨酸在275nm的吸收值为基础，酶活单位定义为：在测定条件（37±0.2℃；p 三、实验材料 1、材料 菠萝（70~90%成熟度，榨汁） 2、器材 100ml量筒、500ml烧杯（2个）、100ml烧杯、玻璃棒、漏斗、纱布、干燥器、离心机、紫外分光光度计。 3、试剂 苯甲酸钠、单宁、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）、NaCl、乙酸锌、抗坏血酸、硫代硫酸钠、L-半胱氨酸、Na2HPO4、NaH2PO4、酪蛋白。 四、实验步骤 1、提取 （1）取一定量的菠萝皮汁（约 ml），加5%苯甲酸钠10ml，搅匀，以4000rpm离心7min，取上清液倒入另一烧杯中； （2）缓慢加入0.2%单宁溶液75ml，边加边搅拌约15min，沉淀物析出，静置40min； （3）虹吸除去上清液，沉淀物以4000rpm离心5min，倾去上清液，得酶糊状物。 2、洗涤与保护 （1）酶糊倒入烧杯，加0.1%EDTA溶液100ml，搅匀，再加1.5%NaCl溶液200ml搅匀，4000rpm离心7min，倾去上清液，得酶复合物I； （2）将酶复合物I倒入烧杯，加0.5%乙酸锌溶液20ml，搅匀，静置5min；加0.06%Vc溶液30ml，搅匀，静置5min；再加1.5%NaCl溶液20ml，搅匀静置5min；最后加0.5%EDTA溶液20ml，搅匀静置5min；以4000rpm离心7min，倾去上清液，得酶复合物II； （3）将酶复合物II倒入烧杯，加0.5%硫代硫酸钠溶液20ml，搅匀静置5min；加1% L-Cys溶液10ml，搅匀，以4000rpm离心7min，倾去上清液，得菠萝蛋白酶糊。 3、冷冻干燥 将所得酶糊放入冰室（－12℃ 4、酶活测定 （1）酶液制备 取所得酶制剂0.15g，加入0.05mol/L（pH7.0）PBS定容至100ml，过滤。滤液即为工作酶液。 （2）活性测定 取3只试管，按下表加入试剂，及其他操作。（各试剂于37℃水浴保温至恒定 试剂 管号 1 2 3 酶液（ml） 1%酪蛋白溶液（ml） 1 0 1 1 1 1 混匀，37℃ 1mol/L NaOH（ml） 1%酪蛋白溶液（ml） 8 1 8 0 8 0 迅速摇匀，室温下静置30min 取上清液于275nm波长下测定吸光值 五、结果与讨论 1、计算菠萝蛋白酶得率（g/100g），并计算所得酶制剂的活性（U/g）。 2、讨论影响菠萝蛋白酶得率及活性的主要因素。 课后体会：