pUC19质粒DNA的提取、纯化及检测.docVIP

PAGE PAGE 1 山东大学实验报告 2013年 9 月19日至10月3日 姓名 系年级 2011级生物技术 组别四 科目分子实验 学号 同组者 题目 pUC19质粒DNA的提取，纯化及检测 一、【实验题目】 pUC19质粒DNA的提取，纯化及检测 【实验目的】 掌握碱变性提取法提取质粒的基本原理和方法，理解各种试剂的作用。 掌握质粒纯化的基本原理及各种试剂的作用。 掌握琼脂糖凝胶电泳进行质粒检测分离的原理。 掌握琼脂糖凝胶电泳的制备和电泳方法。 掌握琼脂糖凝胶电泳的观察方法及凝胶成像仪的操作方法。 三、【实验试剂与器材】 材料 大肠杆菌DH5（E.coli DH5） 试剂 LB液体培养基，氨苄青霉素（ Amp）母液（20mg/ml），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，3M NaAc溶液，无水乙醇，70%乙醇，TE溶液，Rnase A,苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），灭菌双蒸水ddH2O，1×TAE，6×loading buffer，Supercoiled DNA Ladder Marker，λ-Hind = 3 \* ROMAN III digest DNA Marker，溴化乙锭（EB） 仪器 培养皿，接种环，三角瓶（100ml、300ml），酒精灯，恒温振荡培养箱，50ml离心管，1.5ml塑料离心管（eppendorf管），高速离心机，漩涡振荡器，移液枪，不同型号枪头（10ul，200ul，1ml），电泳仪，微波炉，灭菌锅，吸水纸，记号笔，移液管，洗耳球，PE手套，橡胶手套，滴管，天平，称量纸，冰箱，凝胶成像仪等 【实验原理】 1.碱变性法提取质粒及酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇纯化质粒 质粒由于分子小、能自主复制、携带抗性基因、便于分离和提取，经常用在DNA重组中，携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，是基因工程中一种非常重要的载体。构建重组DNA分子需要首先从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA。 提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。 碱变性提取质粒DNA一般包括三个步骤：培养细菌以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc（或NaAc）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可以恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。 琼脂糖凝胶电泳 电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。 凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。 分子生物学实验中，常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。选择上述提及的参数或条件主要取决于被分离的DNA片段的大小。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，适