核酸酶定点突变研究.pptVIP

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2019-06-30 发布于广东
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核酸酶定点突变研究.ppt

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实验八核酸酶的定点突变研究;一、实验目的;二、实验原理; 在本实验中我们以来自于Yersinia enterocolitica subsp.Palearctica 的一种核酸酶（Y.NSN）基因为模板进行突变，该核酸酶具有较高的酶活，然而来自于 Yersinia. enterocolitica subsp. Enterocolitica 8081的另外一种核酸酶则具有较低的酶活，所以，通过氨基酸序列比对，对两种核酸酶有差异的氨基酸进行点突变，来探究氨基酸残基对Y.NSN酶活的影响。如下图所示，有15个位点的氨基酸有差异，在这里我们仅选取其中的一处来进行突变以便来掌握定点突变的技术。;;二、实验器材;三、实验步骤; 2.PCR扩增反应完成后，在样品中加10ul loading buffer 全部跑电泳并用切胶回收试剂盒回收目的片段。 3.加入1ul（10U/ul）DpnⅠ,离心混匀1min,37℃温育1-3小时。 4.转化 5.测序挑取2-3个单菌落至1.5ml离心管（1ml LB+lul卡那）中，震荡培养20个小时后取600ul菌液送去测序。 6.突变质粒提取待测序正确后，将剩余的400ul菌液加入20mlLB+20ul卡那（锥形瓶）中扩大培养，大约4个小时后，OD600约为0.8-1.0，用质粒提取试剂盒提取质粒，然后将质粒于-20度保存。;Thank You