生物素－亲和素.pptVIP

食安0501 类春燕 孙隽 陈春艳 孙晓丽 李臻佳 生物素（Biotin）－辅酶R、维生素H 是生物体内广泛分布的一种羧化酶的辅酶，分子中有两个环状结构： Ⅰ环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位。 Ⅱ环为噻唑环，上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子（如：酶、蛋白质、抗体、DNA ）的唯一结构。 利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性生物素，以适合与各种生物大分子结合的需要。主要有用于标记蛋白质氨基的生物素N－羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）和生物素对硝基酚酯(pBNP),其中以BNHS最为常用。近年来，应用长臂生物素（BCNHS）标记生物大分子，可以减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生物有生物素酰肼（BHZ）及肼化生物素（BCHZ）。 亲和素（ Avidin ）－抗生物素蛋白、抗生物素 是从鸡蛋清中提取的一种糖蛋白，它由四个相同的氨基酸亚基组成，亚基之间通过二硫键连接，亲和素的每一个亚基含有一个与生物素结合的位点，并与生物素或其衍生物形成高度稳定的复合物。 生物素－亲和素系统（BAS）用于检测的基本方法有三类： 标记亲和素连接生物素化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素－生物素法（LBA）。 以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为BAB法，或桥联亲和素－生物素法（BRBA）。 将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素－生物素－过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原－抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法，其中A－Ab为亲和素化抗体，B-Ab为生物素化抗体。 1. BA-酶免疫技术 2. BA-分子生物学技术 将引物生物素化，经过PCR反应后,用(链霉)亲和素固定扩增产物，进行下一步的显色或荧光等检测。 在分子生物学技术中较常用的技术还有：将核酸 探针结合上生物素，通过酶或其它示踪物标记的亲和 素进行显色等。 扩增rRNA的目标序列 与生物素化 探针进行杂交 通过微孔板内的链霉亲 和素捕获 被捕获的目标序列再次进 行碱性磷酸酶标记的探针杂交反应 用化学发光微孔法检测 应用 4. BA-免疫印迹技术 该技术将BA技术与免疫印迹技术相结合,进一 步提高检测灵敏度。 免疫印迹技术是在蛋白凝胶电泳和固相免疫 测定基础上发展起来的一种新的免疫学技术。是 凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异性、 敏感性、稳定性及可重复性的有机结合。 5. BA -组织化学技术 6. BA-分离提纯技术 待分离物生物素化，结合于亲和素包被的固相载体上，洗脱后，达到分离提纯的目的。 7. BA-时间分辨荧光免疫技术（BA-TR-FIA） 应用BA-TR-FIA检测肿瘤细胞和血清中的肌酸转移 BB(CK-BB) , 发现CK-BB是乳腺癌的一个敏感指标,前列腺癌病人血中的CK-BB也明显提高,因此认为该方法是研究CK-BB与各种恶性肿瘤关系的敏感特异的方法。 该法中使用生物素化Ab和Eu3+(Eu3+是发光效率、涂敷稳定性、回收成本等最好的荧光粉 )标记的亲和素,通过BA技术的多级放大作用,使得Ag-Ab复合物中的螯合物Eu3+信号更强,提高了检测灵敏度。 * * 生物素-亲和素标记技术 基本原理 生物素与抗体共价交联的方法简单，条件温和，且一般不影响抗体的活性。生物素与亲和素能快速结合，而且反应不受外界干扰，具有高度特异性和稳定性，两者的亲和常数比抗原－抗体反应高10－100万倍，结合快，呈不可逆反应，而且在pH，温度、有机溶剂或变性剂较大的变化范围内均能稳定存在。 原理 亲和素可预包被在酶标板孔内，然后再将生物素化抗体Ab(或抗原Ag)包被于孔内。通过BA将免疫复合物与酶连接起来，能有效地放大EIA法，使其灵敏性增强。 优点 生物素对抗体和酶的标记率高，又不影响其他活性。 生物素亲和素的结合极为稳定，不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。 每个亲和素分子能结合4个生物素，能耦合更多的联结生物素的酶分子，提高EIA的敏感性。 双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法检测 相思子毒素 用亲和素-生物素ELISA检测GPV抗体 生物素亲和素放大酶联免疫吸附法测定双酚A 生物素化的引物扩增目的基因 微孔板内链霉亲和素捕获PCR扩增产物 用地高辛标记的寡核苷酸探针进行杂交 酶标抗体进行显色反应 3. BA-电化学免疫技术 原理