新基因功能研究策略与方法.pptVIP

免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。 该方法的优点是：相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，所处的环境条件也是接近天然状态的，能够反映体内的相互作用情况，也可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物。但应该注意，有时免疫共沉淀的蛋白质并非是直接相互作用，如ElA与p107的共沉淀就是间接的相互作用，这实际上是ElA与p107、p107与cyclin A直接相互作用的结果。另外，其灵敏度也相对较低。 是一种基于转录重建而建立的研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法。其最大优势在于它可以用已经克隆的基因从特定细胞的2HIE表达文库中“钓取”与其编码产物相互作用的蛋白质及相应基因序列。它检测的相互作用在体内发生，无需额外的纯化步骤。但也存在不少局限性，如突出的“假阳性”问题以及所分析的蛋白质必须定位于核内才能激活报告基因（不利于核外蛋白间相互作用的研究）等。另外，融合蛋白的构建也很可能会影响到蛋白质的正确折叠。另外，近年来已初步建立了哺乳动物双杂交系统，以更好地模拟细胞内环境，探明蛋白质相互作用的机理。 * 随着生命科学的发展及研究领域的不断开拓和生物医学研究在分子水平上的不断深入和推进，越来越多的未知新基因和基因的新功能被发现,越来越多的新基因被得以成功克隆，因此对新基因功能的研究显得日益重要，这也是后基因组时代功能基因组学的重要研究内容和首要任务。 一.新基因的生物信息学及体内表达规律分析; 二.新基因的体内表达规律分析 三.功能获得与功能失活策略研究; 四.功能失活策略 五.基因编码产物相互作用蛋白的研究 目前，生物信息学分析已成为新基因功能研究首选和必用方法，其具有方便快捷和经济等优点。研究者往往可以从中得到与新基因功能有关的重要信息，初步推测基因的可能功能，进而制定出进一步的实验室研究方案。 （1）编码产物预测分析 （2）序列同源性分析 （3）蛋白质功能域分析 （1）mRNA水平的表达谱分析； （2）蛋白质水平的表达分析。 要开展新基因功能的研究工作，首要的研究任务摸清新基因在体内的表达规律。包括从mRNA和蛋白质两个水平上来对其基因表达谱进行分析，即看其在各种不同的正常或病态组织细胞中是否表达以及表达的水平高低等.新基因在某一特定的正常组织细胞中的表达水平高往往提示其在其中发挥着重要作用，而新基因在相应的病态组织中的表达异常则提示与该病理过程相关的生物学意义。 新基因功能研究的功能获得策略即通过将新基因直接导入到某一细胞或个体中，通过观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化来鉴定基因的功能，常用的方法有： （1）基因转染技术 （2）转基因技术 通过观察某一细胞或个体在新基因的功能部分或全部失活后的细胞生物学行为或个体表型遗传性状变化来鉴定基因的功能。 常用的方法主要有基于核酸的基因沉默技术和基因敲除等 （1）基因沉默技术 （2）基因敲除 细胞各种基本功能的完成离不开蛋白质之间的相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白质复合物。因此，确定能够与新基因编码的蛋白质表达终产物相互作用的上下游蛋白质分子，也是研究新基因功能的一个十分重要的方面。目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括传统的基亲和分析而建立的免疫共沉淀技术和酵母双杂交系统. （1）免疫共沉淀技术 （2）酵母双杂交系统 研究者往往最开始得到有价值的EST序列，进而通过电子延伸或和相关实验方法获取其全长cDNA序列。这种情况下，首先要进行即是进行全长cDNA序列的开放阅读框查找，推导其编码蛋白质的氨基酸序列。 然后，进行信号肽序列预测分析。初步判定其亚细胞定位，再进行蛋白质的基本理化性质分析，包括氨基酸组成、分子质量、等电点、亲/疏水性等。最后，以已知的氨基酸序列的基础，分析预测其高级结构。 Cs3亚基蛋白的计算机预测分析 包括核苷酸序列同源性分析和氨基酸序列同源性分析，这也是目前生物信息学技术中应用最为广泛的基本技术之一。主要采用BLAST和FASTA程序进行，即从已知的各种核酸和蛋白质序列数据库搜索与新基因对应的功能已知的高度同源基因和蛋白质，从这些已知基因和蛋白质的功能信息中来初步推测和判断新基因的功能。 同时，因为人类全基因组测序已经完成，所以以新基因的cDNA序列来对基因组数据库进行同源性比对，则可很方便地获得与其完全同源基因组DNA 序列及其染色体定位信息，而无需进行荧光原位杂交等基因染色体定位技术，进而还可通过分析其内含子、外显子序列及其调节位点，推测其可能的基因表达调控方式。即通过此法确定了富