生物化学-第三章核酸化学.pptVIP

被测定链的5’ 3’ 二.DNA的二级结构 2.0 nm 小沟 大沟 要点： 1.多核苷酸链的走向 2.螺旋的角度.高度.直径 3.碱基分布及配对规律 4.作用力 （一）双螺旋提出的基础 （二）双螺旋结构要点 双螺旋DNA的结构参数 32.7o 36o 38o -60o 0.255 0.34 0.33 0.27 11 10 9.3 12 2.8 3.4 3.1 4.5 2.0 2.3 1.92 1.8 右75%Na+ 右92%Na + 右66%Li + 左 人工合成 A－DNA B－DNA C- DNA z－DNA 碱基旋转角度 碱基对间垂直距离（nm） 每转碱基对数目 螺距（nm） 螺旋直径（nm） 旋转方向 结晶状态 类型 （三）双螺旋的结构类型 （四）左旋DNA—Z-DNA 要点 1.左旋锯齿状 2.碱基向外 3.只有小沟 4.12bp，4.56nm （五）.绞链DNA（hing-DNA 即H-DNA 要点 ： 1.三联体碱基配对方式 2.第三链位于大沟中 3.两条链反平行排列 4.酸性PH或负超螺旋张力下 B-DNA H-DNA 三、DNA的三级结构 DNA双螺旋的进一步扭曲构成三级结构。 正超螺旋 负超螺旋 双链线性DNA（dsDNA） 如真核生物 双链环状DNA（dcDNA） 如细菌、质粒 单链环状DNA（scDNA） 如病毒、噬菌体 单链线性DNA（ssDNA） 如病毒、噬菌体 连环数（linking number）：在双螺旋DNA中，一条链以右手螺旋 绕另一条链缠绕的次数.以“L”表示。 超螺旋数或缠绕数（writhing number）：右手超螺旋为正， 左手超螺旋为负。以“W”表示。 扭转数（twsting number）：DNA分子中的双螺旋数。以“T”表示。 L=T+W 第四节 核酸及核苷酸的性质 一、溶解性 DNA在PH4.2时溶解度最低。 RNA在PH2-2.5时溶解度最低。 1.水溶性 微 溶于水，不溶于有机溶剂,水中溶解度DNA达2%，RNA达4% 2.盐溶性 DNA-蛋白，溶于1mol/L Nacl ，低盐不溶。 RNA-蛋白，溶于0.14mol/L Nacl ，高盐不溶。 3.不同PH的溶解性 二.两性性质 1.腺嘌呤 2.鸟嘌呤: 4.尿嘧啶 胸腺嘧啶 3.胞嘧啶 三、核酸的紫外吸收特性 在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。 以A260/A280进行定性、定量 DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光 四、核酸的变性与复性 （一）. 变性 变性:稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。 变性表征: 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应） 变性因素: pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛），低离子强度 加热 热变性和Tm : DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。 一般DNA的Tm值在70-85?C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)*2.44 （二）. 核酸的复性 变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。 退火温度＝Tm－25℃ 复性影响因素 片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/ 纯度/溶液离子强度 （三）. 核酸的复性与分子杂交 Δ 退火 复性 杂交 变性 两个不同来源 的DNA分子 第五节 核酸及其组分的分离纯化与测定 一.分离纯化的一般原则 1.防止核酸酶降解 2.防止化学因素降解 3.防止物理因素降解 二.DNA的分离纯化 三.RNA的分离纯化 四.核酸组分的分离纯化 破细胞（1mol/LNaCL） 离心去沉淀（含RNA-Pr） 上清（含DNA-Pr） SDS法/酚法（去蛋白） 离心去沉淀（变性蛋白） 上清（含DNA） 乙醇沉淀 离心收集沉淀（DNA）