细胞生物学试验-武汉轻工大学虚拟仿真试验教学中心.ppt

实验七植物染色体标本制备和观察 实验目的 掌握常规压片法制备植物染色体标本的基本原理和方法。 实验原理 植物染色体标本的制备，常用分生组织，如根尖、茎尖和嫩叶做材料。常规压片法仍是当今观察植物染色体常用的方法，其程序包括取材、预处理、固定、解离、染色和压片等步骤。但压片法的不足之处是染色体很难分散开，染色体容易变形和断裂。 实验仪器、材料和试剂 仪器、用具： 培养箱、显微镜、剪刀、镊子、刀片、培养皿、滤纸、吸水纸、青霉素、染色缸、载玻片、盖玻片、玻璃板、酒精灯。 材料：洋葱鳞茎。 实验仪器、材料和试剂 试剂： 磷酸缓冲液、甲醇、冰醋酸、混合酶液、秋水仙素（或对二氯苯）。 改良苯酚品红染色液：（配方见课本实验24） 母液A：称取3g碱性品红，溶于100ml70%乙醇中（此液可于4℃冰箱中长期保存）。 母液B：取A液10ml，加入90ml5%苯酚水溶液（两周内使用）。 取B液45ml，加入6ml冰醋酸和6ml37%甲醛。此为苯酚品红染色液。 取苯酚品红染色液10ml，加入90ml45%的乙酸和1.8g山梨醇。放置两周后，染色效果较好。此液称为改良苯酚品红染色液。 方法与步骤 （压片法制备染色体标本） 1、取材：把洋葱鳞茎置于盛水的小烧杯上，放在25℃温箱中发根，待根长至2cm左右，于上午9～11时剪下根尖。或者把蚕豆种子预先浸泡6h，然后转入垫有湿润滤纸的培养皿中，置25℃温箱中发芽，幼根长至1～2cm左右，于上午9～11时剪下根尖。 2、预处理：将剪下的根尖置于对二氯苯饱和水溶液，或0.02%秋水仙素溶液中，浸泡处理4h。 3、固定：用水洗净处理过的根尖，经甲醇-冰醋酸（3：1）固定6～12h，再经95%、85%乙醇各半小时，最后转入70%乙醇中，4℃保存备用。 方法与步骤 解离：取出根尖，用蒸馏水洗净，放入1mol/L HCl中60℃解离8～10min，再用蒸馏水洗净。 染色：改良苯酚品红染色液染色5～10min。 压片：把根尖放在载玻片上，切取分生区部分，加一滴染液，用镊子捣碎，盖上盖玻片，然后再盖玻片上放上一滤纸，用铅笔上的橡皮头轻轻敲打盖片，使细胞和染色体分散。 镜检。 学生成果 学生成果 实验八 细 胞 融 合 实验目的 掌握细胞融合原理、应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。 原理 细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。 原理 细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。 实验用品 鸡红细胞、显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片 50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4) 实验步骤 (1)取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。 (2)称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。 (3)取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5ml Hanks液混匀，然后以1,000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。 实验步骤 (4)取上述50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后静置1分钟左右。此全部过程都要求在37℃水浴内进行。 (5)缓慢滴加9ml Hanks液以终止PEG的作用，在37℃水浴内静置5分钟。 (6)离心弃上清后，取一滴融合后的细胞悬液滴片，加盖片镜检。 结果观察 在高倍镜下可以看到有两个或