由DNA聚合酶催化.ppt

第四节 用克隆cDNA作为反应物 一、RNA印迹 二、RNase 保护实验 三、核连缀转录分析 二、RNase 保护实验 RNA酶保护试验(RPA) 是一种利用反义RNA探针与基因表达产物进行液液杂交，对RNA进行定性定量分析的有效方法． 向待测RNA溶液中加入过量的反义RNA探针，互补的部分形成RNA—RNA杂交分子．经RNase选择性水解去除未形成杂交双链的单链．测定未被RNase水解的RNA’探针的长度及含量，即可对待测RNA进行定量和定性析． RPA灵敏度极高，由于用RNase水解RNA—RNA杂交反应中，由单链RNA产生的假带少。 反义RNA探针的制备 反义RNA:与mRNA互补的RNA分子, 也包括与其它RNA互补的RNA分子。 将外源DNA片段插入载体，载体在MCS两侧带有启动子，在RNA聚合酶作用下可以进行RNA转录，添加α-32P-CTP，则DNA两条链中的一条为模板转录生成RNA。所合成mRNA均掺入同位素而得到标记。 通过改变外源基因的插入方向可以控制RNA的转录方向，即以哪条DNA链以模板转录RNA。这种可以得到同义RNA探针（与mRNA同序列）和反义RNA探针（与mRNA互补）。 反转录酶 双链cDNA 优点： 检测灵敏度比Northern杂交高 ； 没有扩增过程，分析的数据真实性较高； 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片