蛋白质含量的测定.ppt

实验四、双缩脲法测定蛋白质的浓度 N 端 C 端 相关知识 目前常用的有五种经典方法： 　定氮法：灵敏度0.2~1.0mg 　双缩脲法（Biuret法）：1~20mg 　Folin－酚试剂法(Lowry法)：50~100μg 　紫外吸收法：5μg 　考马斯亮蓝法（Bradford法）：1~5μg 方 法 灵敏度 时间 原 理 干扰物质 说 明 凯氏定氮法(Kjedahl法) 灵敏度低,适用于0.2 ~ 1.0mg氮,误差为 ?2％ 费时 8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮(可用TCA沉淀蛋白质而分离) 用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长 双缩脲法(Biuret法) 灵敏度低1～20mg 中速 20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物 硫酸铵;Tris缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定, 但不太灵敏; 不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏50～100?g 快速 5～10分钟 各种蛋白质中的Tyr和Trp残基在280 nm处的光吸收 嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可校正 Folin－酚 试 剂 法 (Lowry法) 灵敏度高～5?g 慢速 40～60分钟 双缩脲反应; 磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵; Tris缓冲液;甘氨酸;各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法 (Bradford法) 灵敏度最高1～5?g 快速5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其?max由465 nm 变为595nm 强碱性缓冲液；Triton X-100;SDS 最好的方法; 干扰物质少; 颜色稳定;颜色深浅随不同蛋白质变化 一、实验目的 掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和方法。 进一步掌握紫外和可见光分光光度计的原理和使用方法。 　 加热 ＋　NH3 2 2 H－ 180℃ 双缩脲 2 2 2 2 二、实验原理 双缩脲反应:碱性环境　 H2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O ? 紫色络合物 含有两个或两个以上肽键的化合物均有双缩脲反应 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。 在一定的实验条件下, 未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应, 并于540－560nm下比色, 可通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。 除－CONH－有此反应外，－CONH2， －CH2－NH2，－CS－NH2等亦有此反应。 三、实验仪器、材料和试剂 （一）仪器 吸量管(1ml/2ml/5ml)、试管及试管架、分光光度计。 （二）材料 标准蛋白溶液(10mg/ml BSA)、? 未知液(人血清×10) （三）试剂 双缩脲试剂　溶解0.175 g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶于15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶中，加入30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1~2h，再加蒸馏水对刻度，摇匀备用。 四、实验操作步骤 （一）? 标准曲线的制作 ? 试 管 剂 号 0 1 2 3 4 5 标准蛋白溶液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质浓度(mg/ml) 0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 双缩脲试剂(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 充分混匀后, 室温下(20~25℃)放置30min A540 （二）? 绘制标准曲线