实验一 大肠杆菌的培养和分离课件.ppt

精品文档 实验1 大肠杆菌的培养和分离 精品文档 大肠杆菌 革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌，在肠道中一般对人体无害，但也有一些菌株是对人体有害的，可以侵袭肠粘膜并产生毒素。但是，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌也是基因工程技术中被广泛采用的工具。它以分裂方式繁殖，分裂速度较快。 革兰氏染色：是一种通过对细菌进行染色从而达到鉴别细菌的方法。依据的原理是细菌的细胞壁结构不同，据此可以分为两种：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。染色结果：革兰氏阳性菌染色后用酒精脱色不变色，复染后呈紫色；革兰氏阴性菌染色后用酒精脱色会变色，复染后呈红色。 兼性厌氧：既可以在有氧条件下进行新陈代谢，又可以在无氧状态下进行新陈代谢。但在这两种状况下，体内的生化反应是不同的，也就是说产能途径不同。 精品文档 单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。 培养皿涂布杂菌形成的菌落 （一）菌落 划线法形成的菌落 精品文档 （二）培养基 由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。 LB（Luria-Bertani）液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取液5g/L，氯化钠10g/L。 配制50mL的LB培养基：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加50mL水溶解。 LB（Luria-Bertani）固体培养基：50ml LB（Luria-Bertani）液体培养基中再加入1g琼脂制得。 固体培养基可根据需求制成平面或斜面。 （可用于大肠杆菌的扩大培养） （可用于大肠杆菌的划线分离） 通用的细菌培养基： 细菌培养基需求中性偏碱，霉菌培养基需求中性偏酸。 精品文档 LB液体培养基： 细菌在液体培养基中扩大培养 精品文档 LB固体培养基 倒入平板，用于分离细菌 制成斜面，用于保存 细菌 精品文档 划线分离 涂布分离 单菌落更易分开 操作简单 操作复杂 （三)细菌的分离 精品文档 （三）无菌技术 泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。 1、消毒： 是指杀灭大部分病原微生物的方法。 （1）100℃煮沸5-6min （2）巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min （3）用75%酒精等进行皮肤消毒 （4）紫外线消毒 常用消毒方法： 精品文档 （1）灼烧灭菌 2、灭菌： 是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法。 精品文档 （2）干热灭菌： 160-170 ℃下加热1-2h。 （3）高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min. 精品文档 针对不同的实验器材或材料选择不同的灭菌方式： 各种器皿（如培养皿、三角瓶、取样器的头等）：高压蒸汽灭菌法 灭菌后放入60-80℃的烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分。在进行实验前，需将要使用的器具从烘箱中取出，放在超净工作台上，打开紫外灯和过滤风，灭菌30min。 培养基：一般 121℃灭菌15min 有葡萄糖：500g/cm2（90℃以上）灭菌30min 有尿素等不能加热的物质：G6玻璃砂漏斗（玻璃砂漏斗用后需用1mol/L的HCl浸泡，抽滤去酸） 进行操作时，注意瓶口、壁上等不能沾有培养基，否则易发生污染。 精品文档 大肠杆菌的培养和分离实验操作步骤 精品文档 实验器材 精品文档 精品文档 精品文档 精品文档 培养基（微生物生存的环境和营养物质） LB液体培养基 大肠杆菌菌种斜面 空白斜面 精品文档 （一）培养基的制备与灭菌 取两个250ml的三角瓶，分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，用牛皮纸包装后放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 LB液体培养基——细菌的扩大培养 LB固体培养基——细菌的划线分离 精品文档 （二）倒平板 待灭菌后的固体培养基冷却到60℃时，在超净台上分别将培养基倒入4个培养皿中，每倒入一个培养皿后立即将培养皿置于水平位置上，并轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝固后形成平面。 无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒 操作时右手无名指和小指夹住封口膜，另外三指持三角瓶，左手拿培养皿并打开上盖的一边，在酒精灯火焰旁操作。 精品文档 （三）大肠杆菌的接种 将斜面上培养的大肠杆菌菌种用接种环接种到灭菌后的LB液体培养基中，将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。 注意事项: 1.在火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌，冷却后方能取菌； 3.接种时右手拿着接种环，右手无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜； 4.取菌后封口膜和棉塞复原. 精品文档 三角瓶在37℃，每分钟2