2011酶工程第八章酶的定向进化.pptVIP

1 平板筛选技术 1）根据细胞生长情况筛选突变基因 热 抗生素 pH 高渗透压 低温 有毒物及抑制剂 ?????????????????OD-Monitor OD值测定传感器 2） 依据颜色变化筛选 ?颜色变化是最简便的追踪酶反应的方法，如用对硝基苯基衍生物检测水解酶的活性。根据水解释放出的黄色对硝基苯酚或对硝基苯胺来进行检测。下图显色底物可检测葡萄糖苷酶。 碱性条件显色pH8 大多数酶并不能直接引起颜色变化，为了检测一个没有生色集团的底物的反应，需要将反应产物转变为一个有色化合物。 3）用透明圈筛选突变酶 淀粉酶，蛋白酶等分泌后会在平板上产生水解透明圈 一般酶活越大，水解圈越大。 荧光检测法具有灵敏性高、方法简便的优点，在高通量筛选中被广泛应用，该方法可以使用很稀的底物浓度和极少量的催化剂进行检测。 2 荧光标签与高通量筛选技术 3 噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，利于蛋白酶的催化或蛋白分离 同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一起。 Background provided by m62 Visualcommunications, visit for more information * 酶工程 第八章 酶的定向进化 概述 定向进化的突变技术 定向进化的筛选技术 定向进化的应用 应用过程对酶的要求  在酶催化过程的研究和应用过程中，人们总是期望：1 酶的活力和稳定性越高越好，2 能接受自然界中不存在的各种底物。3 具备良好的催化性能能在非水溶剂等特殊条件下进行催化反应， 第一节概述 天然酶应用过程中出现问题（改造动机）1 天然酶的稳定性差、活性低使催化水平很低、缺乏有商业价值的催化功能；2 越来越多的情况需要一些酶催化很多在自然界中并不存在的各种底物来完成特定的反应过程 根 源 在自然进化过程中，进化保证了酶对环境任何改变的适应能力，没有特定的方向和特定的目标。酶的进化通常只要求酶在生物体内对特定的生物学功能有专一性。 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。而自然的酶只能满足自然界中生命体（而非人类社会）的需要 天然酶-工业酶之间架起桥梁 原始祖先 新物种 新物种 （不定向变异） （定向自然选择） （地理隔离、生殖隔离） 常规育种方式是对自然进化的一种模仿 随机突变+定向选择＝目标突变体 细菌 诱发突变的因素 50 0C培养 突变体库 选择压力（温度） 温度耐受型突变体 最适生长温度为370C 最适生长温度提高了！ 从目前的情况来看，具有新功能和特性的酶可以通过：传统方法：从大量未知的自然种系中寻找；（工作量大）人工物理化学突变基因；（突变部位难控制）酵母细胞的融合杂交；（适用面窄）现代方法：对基因进行体外定向操作，实施突变，主要包括理性设计和非理性设计 常规育种方式在菌种或酶分子的进化上采用人工不可控的随机突变加定向筛选的方式 定向进化是人工可控的随机突变加定向筛选的方式 在人工操作条件下，使发生在自然界中漫长的进化（突变和选择）过程能在实验室中得以模拟，使人类可以按照自己的意愿和需要改造酶分子，甚至设计出自然界中原来并不存在的全新酶分子(全新蛋白质)。 蛋白质(酶)分子定向进化技术的操作流程 人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制 在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库 通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。 第二节定向进化的突变技术 易错PCR技术(error prone PCR) DNA改组(DNA shuflling) 随机引导重组(RPR) 交错延伸技术(StEP) 过渡模板随机嵌合生长(RACHITT) RAISE突变 饱和定点突变 1 易错PCR（error-prone PCR) 原理:通过降低传统PCR中一种或者两种dATP dGTP dCTP dTTP 的浓度并且加入一定量的MnCl2，同时采用低保真度的TaqDNA聚合酶。使基因在扩增时能随机的创造突变。遗传变化只发生在单一分子内部,故属于无性进化(asexual evolution) 操作手段： １）降低氯化镁的浓度 ２）是添加氯化锰 ３）是降低其中某一种单核苷酸的浓度或者用核苷酸三磷酸盐类似物替代其中一种单核苷酸 关键：选择适当的突变频率 优点：快速、简便、操作方便 缺点：它比较费力耗时,一般适用于较小的基因片段( 800bp) 2 DNA改组（DNA Shuffling) 1994，Stemmer等首次提出体外重组技术，是