2015免疫学实验方法.pptx

Commonly used immunological methods;免疫;免疫学检测与免疫学技术; 免疫学检测是应用免??学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。 ? 免疫学技术的应用极为广泛，疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。 ; (一)细胞计数—细胞计数板 *准备细胞计数器：70%乙醇 →制备单个细胞悬液：贴壁细胞需胰酶消化 →加样 →细胞计数：100倍镜下观察，“计上不计下，计左不计右”;细胞密度： 每毫升培养基中活细胞的个数=每个方块内细胞的平均数×细胞稀释比例×104;(二)免疫细胞功能的测定 1．T细胞功能测定 （1）T淋巴细胞增殖试验：T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原（PHA、ConA）刺激后可发生增殖，可通过以下三种方法检测。 1）形态计数法;2）3H-TdR或125I-UdR掺入法;3）MTT（噻唑蓝）比色法; 1. 细胞的增殖和细胞毒实验，一般可在96孔细胞培养板中进行。 2. 每孔加入100微升细胞悬液。细胞的数量取决于实验目的和培养时间。增殖实验每孔通常加入103个以上数量的细胞；细胞毒性实验每孔至少加入5x103个或以上数量的细胞(具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素确定)。 3. 接种的细胞按照实验需要，送入细胞培养箱进行培养。增殖实验通常要给予0-10微升特定的药物或生长因子进行刺激。细胞毒实验通常要给予0-10微升抑制因子或细胞毒药物； 4．培养结束后，每孔加入20微升MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育3－6小时； 5．孵育结束后，每孔加入100微升甲簪溶解液，在37℃细胞培养箱内再继续孵育，直至在镜下观察甲簪全部溶解。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会略长。 6. 在570nm测定吸光度。如无570nm滤光片， 560-600nm范围的滤光片均可使用。;（2）迟发型超敏反应（DTH）的检测：此方法为体内检测细胞免疫功能的简便易行的皮试方法。其原理是外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血、渗出，于24~48小时发生，72小时达到高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的可发生水肿，甚至坏死。;2．B细胞功能测定 B细胞受多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，活化、增殖，最后分化为浆细胞，产生抗体。抗体可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是测定B细胞功能的最主要的方法。 （1）B淋巴细胞增殖试验：LPS或PWM刺激; （2）B细胞产生抗体能力的检测：;3．细胞毒试验 细胞毒实验技术是检测CTL、NK等细胞杀伤靶细胞活性的一种细胞学技术。主要用于肿瘤免疫、移植排斥反应和病毒感染等方面的研究。;;（2）乳酸脱氢酶释放法：细胞受损，LDH释放，LDH在催化乳酸生成丙酮酸的同时将NAD+还原成NADH。后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm或570nm波长处读取的OD值，经计算即可得NK细胞活性.;4．吞噬功能测定 （1）硝基蓝四氮唑试验：硝基蓝四氮唑（NBT）是一种水溶性的淡黄色染料。由于在杀菌过程中产生反应性氧中间物（ROI），其中超氧阴离子（O2-）能使被吞噬进细胞内的NBT还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中，光镜下计数NBT阳性细胞，可反应中性粒细胞的吞噬功能。 ;（2）巨噬细胞吞噬试验：将待测巨噬细胞与某种可被吞噬又易于计数的颗粒性物质（如鸡红细胞）混合温育后，颗粒物质被巨噬细胞吞噬，根据吞噬百分率即可反映巨噬细胞的吞噬能力。;三、细胞因子的检测;ELISA三个必要试剂： （1）固相的抗原或抗体， 即免疫吸附剂（immunosorbent）; （2）酶标记的抗原或抗体， 称为结合物（conjugate）； （3）酶反应的底物。;a.包被 b.抗原抗体反应 c.酶促反应,显色 d.终止显色，读取数据。 ;用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：;双抗体（原）夹心法测抗体;包被特异性抗体;☆双抗体夹心法测抗原特点; 间接法测抗体; ☆ 操作步骤： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤。 （2）加稀释的受检样本，其中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，孵育洗涤。 （3）加酶标抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标