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第三节 培养条件的选择与控制 植物细胞、组织、器官无菌培养与多种条件或因子有关，培养条件是整个组织培养的难点和重点。培养条件包括 光照---能量的来源 温度---新陈代谢的实现 湿度---气-水平衡的保证 培养基---外植体（植株）营养的来源 谷迎春等在研究黄金球切花菊组织培养时发现，温度对菊花试管苗生长有显著影响：温度在28℃时，试管苗长得最高，但增殖倍数低，仅为4.22倍；温度在26℃时，其增殖倍数最高，为5.63倍。 可见，分化增殖过程中，温度保持在26℃左右，有利于苗的分化。同时温度在26℃，其根长和生根条数都远远超出其它两个处理，所以，试管苗生根的最佳温度也是26℃。 低温处理在植物组织培养中也是用得较多的措施之一，因为它能促进器官分化，提高诱导、分化频率。常用的低温处理方法有以下3种：（1）接种前低温处理。（2）接种后低温处理。（3）组培苗的生根和移栽的低温处理。。 二、光照 光照的影响表现在光照时间、光照强度、光周期三个方面。 对于大多数植物，每天14～16小时的光照，8～10小时的黑暗即可保证正常生长、发育的需要。 植物组织培养通常以碳源作为能源，光照主要是满足形态建成的需要。 光周期对诱导和花芽的形成有明显的影响。 三、气体 任何植物在进行细胞、组织培养时，都要进行光合作用和呼吸作用。在一定气体（包括O2和CO2）的动态平衡下，培养物得以正常的生长、分化、发育。 传统植物组织培养方式下封闭式小容器内光照弱，CO2亏缺，空气温度过高，容易累积乙烯等有害气体是造成培养小植物体生长缓慢、弱小和移栽成活率低的重要因素。 在进行液体培养时，必须经常转动或使用震荡摇床进行震荡培养，促进培养物的氧气交换，才能充分发挥液体培养高效的增殖作用。 外植体一般分为三类。**带芽的外植体，如茎尖、侧芽、鳞芽、原球茎等，组织培养过程中可直接诱导形成丛生芽的。其获得再生植株的成功率较高，变异性也较小，易保持材料的优良性状。**根、茎、叶等营养器官和花药、花瓣、花轴、花萼、胚珠、胚、子房、花药、花粉、果实等生殖器官以及贮藏器官的薄壁组织、维管束组织。这一类外植体需要进行脱分化，经过愈伤组织阶段，再分化出芽或产生胚状体等，才能形成再生植株。**细胞或原生质体，培养后通过直接或间接发生途径发育成植株，但在培养过程中要保证这些细胞或原生质体的渗透压，防止破裂或结构的崩溃。 3．器官的生理状态和发育年龄 一般认为，沿着植物的主轴，越向上的部分，所形成的器官的生长时间越短，其生理年龄也相应越老，越接近发育上的成熟。反之，越向基部，其生理年龄越小。因此顶芽比腋芽容易分化；萌动的芽比休眠芽容易分化。如在石莲花叶的培养中，用幼小的叶作培养材料，仅产生根，用老叶片培养可以形成芽，用中等年龄的叶片培养，既可以产生根，也能产生芽。 二、灭菌和消毒（一）培养基的灭菌和消毒1. 培养基的湿热灭菌 培养基的灭菌一般采用高压灭菌锅进行湿热灭菌。培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密封的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而高压锅内的温度也随之增加。在1.05～1.1 MPa的压力下，温度达121oC。从而杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。一般消毒15～20分钟。 高压灭菌后的培养基，通常会产生一些变化：（1）、pH值会上升0.2～0.3单位。（2）、蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在8%～20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基渗透压约升高0.43倍。（3）、培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖分解，使15%～25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基pH值小于5.5，其水解量更多。培养基中加入0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。 为了防止高压灭菌产生的上述变化可用下列方法：（1）经常收集相关文献资料，以便及时采取有效措施。（2）设计培养基配方时，尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量（在0.1%以下），注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。（3）配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙、铁放在最后加入。（4）注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。如高压灭菌后的pH值常常由5.8上升到6.48，而96小时后又回降到5.8左右。 （二）用具的灭菌和消毒1．用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用时放在酒精灯上灼烧灭菌，冷却后进行无菌操作。完毕后再插入95%