6 7 色谱聚焦 亲和色谱8.ppt

第六章 色谱(层析）聚焦Chromatofocusing 第一节 概述 据生物分子pI的不同，在动相中动速不同进行分离（适于水溶性的两性分子） 特点： ⑴.自动形成pH梯度，不需特殊实验装置； ⑵.蛋白质聚焦自身pI范围，有浓缩效应，峰宽达0.04-0.05pH单位，分辨率很高。 第三节 PB与PBE 一、PB（polybuffer）-多组分缓冲液 为分子量不同的多羧基多氨基化合物 （两性电解质性缓冲剂） 特点： ⑴.I不高，但缓冲力强； 　　　　 ⑵.缓冲能力是均匀的。 二、PBE(polybuffer exchange) ——多缓冲交换剂 以交联琼脂糖Sepharose CL-6B为基质，并在糖上通过醚键偶合上配基而成 如低聚乙烯亚胺 要求： 确保很宽的pH范围有均衡的缓冲容量。 第四节 实验要点 步骤 样品pI的查阅或测定 选PBE，PB和起始缓冲液 装柱，平衡 安装仪器（增pH计） 加PB少量入柱 加样 加PB洗脱 再生 PBE 洗脱液 脱PB 一、PBE，PB和起始缓冲液的选择 ⑴. 查pI或测定 ⑵. 由pI确定pH梯度范围 最大范围 3～3.5 为提高Rs,选择的pH范围应含要分离样品pI，并使其有2/3～1/2的柱长的吸附解吸时间。 ㈢.由产品性能表选择 ⑴. PBE94 ⑵.选始缓冲液pH9.4，乙醇胺-HAC （0.025） ⑶.选PB96 用HCl调pH7.0 二、装柱 ㈠.PBE量 由样品量确定PBE量 一般100mgpr/10ml床体积、每pH单位 ㈡.柱选择 H/D=30～60 ㈢.充填（同前） ㈣.平衡 用始缓平衡，要求： ⑴.缓冲液使用前应先脱气，以除去其中CO2 ⑵.需平衡到进出液pH、I、电导都一样。 ㈤.校验 柱装好坏，用有色的牛细胞色素C检查。 三、样品 ㈠.VS 因聚焦浓缩效应，VS最大可达50%～2Vt 但最好≤0.5Vt ㈡.I＜0.05 ㈢.加样 要求： ⑴.上样前应先加5mlPB，以免…… ⑵.需使样品均匀平整加在床面上 四 、洗脱 ㈠.洗脱剂用量 pH 取决于洗脱剂浓度 梯度 浓度大，峰间距小 范围 浓度小，峰宽大… 梯度体积 一般：12～13Vt ㈡.流速 一般线速在30～40cm/hr ㈢.检测 主要是目的物浓度、pH 五、PB的除去 1.沉淀法：加硫铵，再透析 2.凝胶过滤：常用Sephadex G-75 六、再生 一般：①.先除去吸附的杂质 对pI＜6，在柱顶，可用1mol/LNaCl 对pI很小，可用0.1mol/LHCl ②.用起始缓冲液平衡 七、保存 24%乙醇 八、结果讨论 ㈠.顶替（取代）效应 带电量除与pI有关，还与滴定曲线有关，B在pH更高才被吸附 （如下图所示） 后期I的增加 出现竞争性结合 影响B类分子的吸附 造成B类分子提前洗脱 ㈡.陶南效应（阴IE） 因表观pI下降，出现滞后洗脱。 ㈢.溶解度 造成滞后洗脱 因pH pI时S ，往往需更低pH时， 其S ，才被洗出。 第五节 技术的应用 蛋白质类（包括酶）的分离 蛋白质类（包括酶）等电点测定 P175-177 第七章 亲和色谱 Affinity Chromatography, AC 第一节 概述 原理 利用生物体中许多高分子化合物具有和某些相对应的分子可逆结合的特性建立的色谱法。 一、特点 高效、高收率、有浓缩效应，使用局限性 二、应用 高效从复杂混合物中得某一种物质； 基于生物功能可把有活性与无活性分开 三、基本过程 须找配基（它与底物专一可逆结合如下图） 说明： 1.偶联用Gel（须是活化偶联介质） 2.亲和吸附剂 高度专一亲和吸附剂 类专一亲和吸附剂 3.按相互作用力划分： 次级键——亲和色谱 配位键——螯合色谱 共价键——共价色谱 疏水键——疏水色谱 亲和层析的必要条件: 合适的配体（配基、ligand) 合适的载体（Matrix) 合适的吸附和洗脱条件 第二节 亲和色谱配基 (ligand L) ㈠ 作为配体的条件 亲和力大;具有解离平衡;与载