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临床用PCR检测常见的问题及科华PCR试剂特点 曹玉峰　上海科华生物工程股份有限公司 目前PCR的应用 核酸是最基本的生命物质，其贮存着生物体的全部遗传信息，直接或间接的参与所有生命过程。 理论上任何疾病都能在核酸水平找到证据。 随着对核酸功能认识的逐渐深入，核酸检测在医疗诊治过程中起着越来越重要的作用。 核酸检测在临床上主要应用于： 能用于遗传性疾病、肿瘤以及感染性疾病的筛查以及疗效监测等方面 由于对基因功能认识的限制，国内主要进行病原体载量检测，用于疗效监测 核酸检测的特点 核酸检测相对于传统的生化、免疫检测有着不同的检测方法及生理意义。 早期筛查：应用PCR进行早期筛查主要是因为PCR的高灵敏和短的窗口期。 疗效监测：反映抗病毒治疗效果的最好指标。 核酸是病毒存在的直接证据，用核酸定量作为监测指标更灵敏。而传统的血清标志物有滞后效应，效果不如核酸理想。 与酶免检测互补： 方法学互补，可以避免亚型或免疫沉寂引起的漏检 临床作用互补 临床PCR检测的常见问题 假阳性问题 方法学问题 污染问题： 样本污染、产物污染 假阴性问题 试剂因素、操作因素、仪器因素、标本因素 定量问题 外标定量与内标定量 假阳性问题及解决办法 方法学：PCR是特异性非常高的检测方法 PCR引物决定了特异性 靶基因序列的特异性、引物错配、非特异性扩增 实时荧光（Real-time）：引物探针同时控制，几乎没有方法学假阳性问题 污染： 样本污染：应属于操作失误，所有技术都存在，但由于PCR高敏度轻微污染也能被检出。 产物污染：最严重的问题 PCR产物是极高浓度的，所以很可能产生污染 解决办法： 使用实时荧光技术 严格分区及实验人员培训 使用UNG技术 UNG/dUTP消除产物污染 原理： UNG酶是一种限制性水解酶，会将dUTP降解。在PCR体系中以dUTP代替dTTP，这样合成的产物就含有U，而模板只含T不含U，如果出现产物污染，UNG酶会降解掉产物，而对模板无影响。 步骤： UNG酶反应，50℃ UNG酶灭活，94℃ 开始扩增循环 UNG/dUTP消除产物污染 UNG/dUTP消除产物污染 UNG/dUTP消除产物污染 UNG/dUTP消除产物污染 假阴性问题及解决办法 试剂因素 阳性对照可以监测和发现 操作因素 提高操作人员素质 降低操作难度（柱提取、磁珠提取等） 阳性对照监控 仪器因素 离心、温度控制精确度 仪器故障、由阳性对照（或标准曲线）监控 孔间因素，使用内对照监控 标本因素 使用抗干扰能力强的试剂（煮沸二步法、柱提取等） 使用内对照 定量相关的问题 外标定量的前提： 假设所有扩增的扩增效率一致 所以能影响扩增效率的因素都能影响定量结果 核酸定量没有决定性方法 只有同类著名试剂（罗氏）作为参照标准 PCR定量重复性不好，10倍以为大体都正确，不能同生化类比 PCR标准品没有准确的定量值 国家标准也是8倍左右的范围值 外标定量与内标定量 内标定量 将标准品加入样本中一齐处理、检测 优点： 标准品和样本的反应完全一致，误差最小定量最准确 缺点： 只能一点定标，线性范围有限，ＰＣＲ定量是指数级范围，不适用 标准与样本的信号区分要不同的检测信号，难度大，成本高 外标定量 标准同批，分管处理检测 优点： 能做标准曲线定量，线性范围宽 成本低，易实现 缺点： 反应情况的同步性不如内标定量 科华PCR试剂盒特点 及新进展 试剂盒三大特点： 提供负压纯化柱提取及磁珠提取方法 使用双色荧光设计内标，避免假阴性 标准品参与提取 PCR检测核酸提取是关键 核酸提取 循环扩增 结果检测与分析 PCR的新进展 酶的稳定性增强 经过免疫或化学修饰后酶的稳定性有大幅度增强 但配置后长期存放仍然不利 提取方法的进步 煮沸、柱提取、磁珠提取 自动化 半自动、全自动 常见的核酸提取方法 煮沸法提取核酸 第一步：加沉淀剂，离心弃上清 去除小分子聚合酶抑制物 浓缩病毒颗粒，提高灵敏度 第二步：加裂解液，煮沸 裂解病毒颗粒，游离核酸 变性残留蛋白质 第三步：取上清扩增 去除大分子聚合酶抑制物 负压纯化柱抽提原理 原理：采用硅胶膜特异性吸附核酸，而对其他生化组分如蛋白质、多糖、脂类既不相亲也不吸附，因而可得到纯化的核酸 负压纯化柱抽提操作 裂解 ↓ 移入柱 ↓ 洗涤两次 ↓ 洗脱 负压纯化柱抽提的优点 操作难度低，易于掌握 纯度高 适应性强：能用于各种DNA、RNA病毒 提取物可用于其他分子生物学检测 对离心要求低 对实验环境无污染 磁珠法提取原理 原理： 标本中的病毒经裂解、消化后，释放出病毒核酸，核酸与磁珠结合(特异性的和非特异性的)利用磁珠分离仪器将病毒核酸提取纯化，作为PCR反应的模板。 分类： 亲和法：提取全核酸，特异性差 杂交法：利用特异