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土壤脱氢酶活性的测定 一、实验原理 脱氢酶的正式命名是AH：B氧化还原酶，广泛存在于动植物组织和微生物细胞内，它能酶促一定的基质中脱出氢而进行氧化作用。脱氢酶的种类因电子供给体和接受体的特异性而有不同。单位时间内脱氢酶活化氢的能力表现为它的酶活性。通过测定土壤中微生物的脱氢酶活性，可以了解微生物对土壤中有机物的氧化分解能力，即土壤酶的活性。 已知受氢体可接受脱氢酶脱出的氢原子，根据接收氢原子的量可以判断脱氢酶的活性。如无色的氯化三苯基四氮唑（TTC，俗称红四唑）接受氢后变成红色的三苯基甲瓒（TF），根据产生红色的色度进行比色定量分析，就可以判断脱氢酶的活性。通常，吸光度越大（红色越深），脱氢酶活性越大。 二、实验材料、试剂和仪器 1．材料：过0.9mm孔径筛的土壤样品，8g 2．试剂：0.36%Na2SO3溶液，15ml Tris-HCl缓冲液（PH=7.6），45ml 0.4%TTC,7.6ml Na2S2O4，十几粒 甲醛，10ml 丙酮，20ml 3．仪器：50ml具塞比色管，6只 比色管架，1只 1~5ml移液枪，1只（枪头3个） 100~1000ul移液枪1只（枪头1个） 药匙1个 水浴锅1个 分光光度计1台 分析天平1台 离心管4只 培养箱1台 离心机1台 三、实验步骤 1．标准曲线的绘制 （1）按下表配制系列浓度的TTC标准溶液。 序号 0 1 2 3 4 5 0.36%Na2SO3（ml） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Tris-HCl(ml) 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 0.4%TTC(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 配成的TTC标准溶液的浓度（?g/ml） 0 8 16 24 32 48 （2）显色。 用药匙向每只比色管中各加入少许连二亚硫酸钠（Na2S2O4），混匀，使TTC全部还原为红色的TF。用1~5ml移液枪向各管滴加1ml甲醛终止反应，摇匀后再加入2ml丙酮震荡摇匀，37℃水浴10min （3）测定吸光度，绘制标准曲线。 在485nm波长下测定各管溶液的吸光度A，并以A为纵坐标，TTC浓度为横坐标，绘制出TTC标准曲线。 2．土壤脱氢酶活性的测定 （1）培养并显色（此步骤由助教预先完成）。 首先，按下表向四只离心管中分别加入以下物质 对照组 土样1 土样2 土样3 过2mm筛的土样 2g 2g 2g 2g 0.4%TTC 0ml 2ml 2ml 2ml 蒸馏水 2ml 0ml 0ml 0ml 然后，将以上四只离心管避光，37℃保温培养12~24h （2）培养结束后，用1~5ml可调式移液枪向各管分别加入1ml甲醛终止反应，再分别加入2ml丙酮震荡并于37℃下水浴保温10min （3）离心。将各离心管置于离心机中，4000r/min离心5min。 （4）测吸光度。取上清液在485nm波长下测定吸光度A，在标准曲线上查出相应的TTC浓度。 3．土壤脱氢酶活性计算。 脱氢酶活性=ABC 式中，A为由标准曲线上查出的TTC浓度（?g/ml）；B为培养时间校正值（h）;C为比色时稀释倍数（当吸光度值大于0.8时，要适当稀释，使其在0.8以下） 四、实验注意事项 1．所有操作尽量在避光条件下进行。脱氢酶最适反应温度为30~37℃，最适pH值为7.4~8.5，因此要控制好水浴锅的温度和缓冲液的pH 2．取用甲醛时要小心，如若沾到皮肤上要迅速用自来水冲洗。 3．加入还原剂连二亚硫酸钠时，要保证各管加入的量几乎相同，防止因加入不同量的还原剂造成差异。 4．离心管经摇晃后会在管壁上沾有土，因此离心后取上清液测吸光度时，可用吸管吸取上清液到比色皿中，避免吸入土壤颗粒。 5．用过的比色皿如果内壁沾有颜色而难以清洗，可用硝酸浸泡。 五、思考与讨论 影响脱氢酶活性的因素有哪些？ 答：1.反应终止剂的选择：本实验用甲醛作为终止剂，因其能抑制酶活性而使反应终止。但终止剂不止甲醛一种，例如浓硫酸也可作终止剂。但加入浓硫酸会使培养液褪色，背景值增大，且可能长时间会发生茶色反应，影响吸光度的测定。 2.萃取剂的影响：比起其它萃取剂，丙酮的萃取效果较好，吸光度大，与水互溶，不会发生液液分层现象，TF会均匀分布在水与萃取剂的混合液中。 3.TTC浓度的影响：TTC浓度影响很大，浓度上升时，TF的产量也增大。但从已有研究来看，当TTC浓度过大时，TF产量会下降。过高的TTC浓度不仅不会促进TTC还原反应，反而会抑制酶活性，使反应终止。 4.温度和pH的影响：反应的最适温度为30~37℃ 5.培养时间的影响：根据酶活性的测定原则，培养时间应尽量短些，以避免因基质