基因重组工程.pptVIP

四、DNA连接酶(DNA ligase) DNA连接酶可以 催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3ˊ－OH与另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNA长链。 DNA连接酶的用途 （1） 两个双链DNA片段连接起来 5ˊ- ACG AATTCGT-3ˊ T4DNA连接酶 5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ 3ˊ- TGCTTAA GCA-5ˊ 3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ （2） 修补带有缺口的双链DNA分子 T4DNA连接酶 五、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶(BAP) 能够催化水解去除DNA或RNA5ˊ-端的磷酸基团。 用途 ⒈ 制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5ˊ－端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。 ⒉ 用32P标记5-端前，去除5-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5-端进行标记。 六、末端 （脱氧核苷酸）转移酶(TdT) 作用 将标记或未标记的dNTP加到DNA的3ˊ—OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片断上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。 应用 ① 探针标记 P32-α.dGTP G32G32G32G32 G32G32G32G32 ② 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接 重要的工具酶 工具酶 活性 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA T4 DNA连接酶 催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基 形成磷酸二酯键 DNA聚合酶 以DNA为模板合成DNA 逆转录酶 以RNA为模板合成DNA 碱性磷酸酶 切除末端磷酸 T4多聚核苷酸激酶 催化核酸5-羟基磷酸化 末端脱氧核苷酸转移酶 催化3-端合成同聚体尾 第二节 基因克隆常用的载体 载体(vector) 是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为DNA 。 本节主要内容 载体必须具备的基本条件 载体的种类 常用的载体 一、载体必须具备的基本条件 ⒈ 有自身的复制子，能独立复制 ⒉ 具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点) ⒊ 具有遗传表型或筛选标记 ⒋ 有足够的容量以容纳外源DNA片段。 ⒌ 表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动 子、前导序列、增强子等调控元件。 ⒍ 载体DNA中均有一段非必需区，将外源基因插入 该非必需区，而载体本身不受影响。 二、载体的种类* （一） 克隆载体 用来克隆和扩增DNA片段的载体，具有3点共性： ⑴ 能够在受体细胞复制； ⑵ 带有药物抗性基因，便于筛选； ⑶ 可导入受体细胞。 （二）表达载体 除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件——转录和翻译所必须的DNA顺序。 三、常用的载体 （一） 质粒 (plasmid)： 是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。 作为克隆载体的质粒应具备以下特点： 1. 分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内， 有较高的拷贝数 2. 具有1个以上的遗传标志，便于筛选 3. 具有多克隆位点 总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。 广泛应用的质粒： pBR32质粒、pUC系列等 pBR322质粒 ① 4363 bp ② 含一个复制点 含一个抗氨卞青霉素标 记(ampR) ④ 一个抗四环素标记 (tetR) ⑤ ampR和tetR基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入 当外原基因插入抗药基因位点时，AmpR→Amp敏感(AmpS )、TetR→Tet敏感(TetS). pUC系列质粒 由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体； （1） 2674bp； （2） 有ampr和与M13噬菌体 相同的多克隆位点（MCS） （3）有一个来自大肠杆菌的LacZ操纵子的DNA片断, 编码半乳糖苷酶 (二)λ噬菌体 组成特点： 双链线状DNA分子， 全长50kb， 含65