食品检验检疫新技术.ppt

第四章 食品检验检疫新技术 第一节 免疫学检测技术 1.基本概念 抗原：凡能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与之结合引起特异性免疫反应的物质称为抗原。 抗体：在抗原刺激下产生的，并能与之特异性结合的免疫球蛋白。 血清学试验：抗原抗体在体外发生的特异性结合反应、抗原抗体的反应一般都要用血清，故称为血清学试验或血清学反应。 免疫学检测方法的原理：是借助抗原和抗体在体外特异性结合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定量或定性的检测。 可以作为抗原进行检测的物质分为以下四类： 各种微生物及其大分子产物； 生物体内各种大分子物质； 人和动物细胞的表面分子； 各种半抗原物质。 酶联免疫吸附试验是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，其基本原理是抗体（抗原）与酶结合后，仍能和相应的抗原（抗体）发生特异性反应，将待检测样品事先吸附在固相载体表面称为包被；加入酶标抗体（抗原），酶标抗体（抗原），与吸附在固相载体上的相应的抗原（抗体）发生特异性反应，形成酶标记的免疫复合物，不能被缓冲液洗掉；当加入酶的底物时，底物发生化学反应，呈现颜色变化，颜色的深浅与待测抗原或抗体的量相关，借助分光光度计的吸光度计算抗原（抗体）的量，也可用肉眼定性观察。 抗原抗体的特异性和敏感性，使得食品在未经分离提取的条件下，即可进行定量和定性分析，而一般的化学分析都需要经过分离提取等复杂过程。近年来，该项技术主要用于细菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生虫的检测；用于蛋白质、激素、其他生理活性物质、兽药残留、农药残留、抗生素等的检测。 第二节 核酸提取方法与探针技术 样品增菌后的核酸提取方法： 热裂解法 反复冻融法 酶裂解法 微波法 化学裂解法 超声破碎法 样品无需增菌的核酸提取方法： IMS法（免疫磁珠法） FTA滤膜吸附法 病毒核酸的提取： 异硫氰酸胍-SiO2法：异硫氰酸胍可以裂解细胞壁，并灭活核酸酶，释放出来的核酸被经处理的SiO2所吸附，从而达到纯化目的。 Glycine-PEG-Tri-reagent-poly(dT)法：通过调节PH和PEG沉淀核酸，再用poly(dT)纯化核酸。 探针技术 探针的标记物分类： 放射性同位素 非放射性标记物：是通过酶促反应将特定的底物转变为声色物质或化学发光物而达到放大信号的目的。常用的标记物金属、荧光染料、地高辛、生物素和酶等，可通过酶促反应、光促反应或化学修饰等方法标记到核酸分子上。 探针的标记方法： 缺口平移法 随机引物法 末端标记法 PCR标记法 第三节 PCR检测技术 PCR即聚合酶链反应的简称。 PCR是在体外模拟DNA复制的过程，在体外合适的条件下以单链DNA为模板，以人工设计和合成的寡核苷酸为引物，利用热稳定的DNA聚合酶延5’-3’方向渗入单核苷酸来特异性的扩增DNA片段的技术。整个反应过程通常由20-40个PCR循环组成，每个循环由变性、退火、延伸三个步骤组成。 PCR的种类： （1）多重PCR （2）免疫PCR （3） PCR-SSCP分析技术 （4）实时荧光定量PCR （5）反转录PCR （6）不对称PCR （7）反向PCR PCR检测技术的应用： （1）检测产单核细胞李斯特菌 （2）检测金黄色葡萄球菌 （3）检测沙门氏菌 （4）检测致泻大肠杆菌 第四节 基因芯片技术 基因芯片又称DNA微阵列，是指由按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所构成的微点阵阵列。在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的互补核酸片段杂交。如果把样品中的核酸点段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。 基因芯片技术可以应用于转基因食品的检测中。 基因芯片的分析步骤 (1)样品活化 (2)靶DNA的选择 (3)PCR扩增 (4)玻片的活化 (5)芯片的制备 (6)杂交 (7)洗涤 (8)扫面玻片和数据处理 检测转基因食品基因芯片的制备方法： 选择目的片段 根据食品原料来源的具体情况选择不同基因或其片段作为检测对象，分别设计扩增引物，PCR扩增获得探针，将探针纯化，浓缩后点样于固相支持物上。 转基因食品DNA的提取 目的片段的扩增和标记 杂交和洗涤 杂交结果的检测：以基因芯片扫描仪在一定波长进行扫描检测。 第五节 生物传感器 生物传感器由一种含有固定化生物活性物质（如酶、抗体、全细胞、细胞器或其他联合体）做敏感元件，配上适当的换能器所构成的分析工具（或分析系统）称为生物传感器。它可将生化信号转化为数量化的电信号。 生物传感器一般由两个主要部分组成：一是生物分子识别元件（感受器），是具有分子识别能力的生物活性物质（如酶、抗体