高级生化-蛋白质分离分析.pptVIP

第六节蛋白质的分离纯化和分析 一、蛋白质分离纯化的一般程序 （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。 1. 机械破碎法 ——利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 ——在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。该法简单方便，但对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等应根据性质而定。 如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（SDS、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。 在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离。主要根据蛋白溶解度的差异。 1. 等电点沉淀法 2. 盐析法 分步盐析分离不同蛋白质。被盐析沉淀下来的蛋白