荧光原位杂交(FSH).ppt

荧光原位杂交;原位杂交（ISH）;基本原理;3H、35S、125I、32P等 ;同位素原位杂交的不足之处： 1、不稳定 2、高背景 3、曝光时间长 4、结果统计处理繁琐 5、同位素的使用和处理;几种原位杂交技术;荧光原位杂交;FISH的基本原理;发展历史;1969 年Gall 和Pardue 以及Pardue 等人利用放射性同位素标记的核酸探针对DNA进行了杂交,开创了RNA-DNA 的同位素原位杂交技术。 他们都是采用放射性同位素标记探针,需要采用放射自显影进行检测,这种检测上的限制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原位杂交技术不能很快得到广泛应用。;;;20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。 ;FISH样本的制备;DNA RNA PNA;探针的制备;探针的分类;肽核苷酸（PNA）探针 PNA寡聚物是??类新分子，其结构与DNA相似。但在PNA中，没有核糖-磷酸基骨架，其骨架是不带电的肽链(聚酰胺）。 ;PNA与DNA杂交时也遵循碱基互补配对原则;与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA的结合不依赖于离子强度，因此杂交时，受探针变性温度和溶液PH的影响较小，鉴于这些特点和优点，PNA有望取代DNA或RNA作为FISH的探针。但由于PNA探针只能通过化学方法进行合成，而且合成费用高，因此迄今所用的PNA探针还仅限于染色体的泛着丝粒和泛端粒探针。;寡核苷酸探针 它是根据探针靶序列的碱基顺序用化学方法合成的单链DNA，其长度为15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小，限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重复序列的荧光原位杂交分析。;探针标记;对探针进行标记时，可复制合成一段新探针分子，在复制合成过程渗入标记核苷酸，从而使整个新分子被均匀地标记。其显著的特点是标记不局限一个位点，而是均匀地渗入，探针的信号强。 均匀标记有切口平移法、随机引物法和PCR扩增等方法。;切口平移标记法;切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一般对克隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。 该方法使用时应注意： A.只能标记双链DNA 使用探针时要预先变性后再使用，而且标记时DNA片段不太小 B. DNA酶I使用的量要合适 太多会将DNA模板切碎，不能进行标记反应；太少则不能有效地打开缺口，使标记物不能进入缺口 C. 标记时间不能太短 太短时间会造成标记量不足，影响杂交的进行 ;随机引物标记法;1、不但可用于双连DNA的标记，而且可用于单连DNA和RNA的标记 2、操作简单 3、标记率高;PCR标记法;末端标记;末端标记法;染色体显带;每条染色体都含有一定数量、一定排列顺序、一定宽窄和染色深浅或明暗不同的带,这就构成了每条染色体的带型。显示染色体带的过程称为染色体显带。 染色体显带为染色体的研究提供了一个十分有效的方法。 染色体的显带技术分为两大类:一类为整条染色体的显带技术；另一类为染色体局部的显带技术。;奥芬兰海水硝化细菌荧光原位杂交;荧光原位杂交特点;5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列； 6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 ; 缺点 1、不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。 2、必须在已知探??的情况下方可进行。;FISH技术新进展;　 ;;荧光原位杂交的发展前景;THANK YOU!