雪龙黑牛活体采卵技术及其在体外受精中的应用.pdf

*1 1 1 2 2 (1.大连雪龙产业集团股份有限公司，辽宁大连 116001 ；2.大连水产学院，辽宁大连 116001) 摘要：利用超声波活体采卵技术(ovum pick-up，OPU)对纯种雪龙黑牛进行活体采卵。探讨了活体采卵 频率和发情激素处理对卵母细胞回收的影响，并对比了活体采卵与屠宰采卵在体外受精中囊胚发育的差异。 结果表明：每周活体采卵 2 次与采卵 1 次可获卵母细胞数差异不显著；采卵前用 FSH 处理不发情母牛和发 情母牛差异不显著，活体采卵和屠宰场采卵的优质卵母细胞数和囊胚率差异显著。 关键词：活体采卵；体外受精；超声波扫描仪；卵母细胞 前言 活体采卵技术是 20 世纪 90 年代发展起来的一项新型获得优秀种母牛卵母细胞技术。首 次报道牛的 B 超活体采卵技术在 1988 年 Pieterse 等[1]，该技术与体外胚胎生产技术相结合， 克服了超数排卵和屠宰取卵的部分缺点，它可对幼畜进行取卵，缩短世代间隔，加速养牛业 的进程;体外受精技术不仅能加快优良品种的繁育进程，批量生产良种胚胎，且可以保存优 良品种使其得到扩繁，可对具有遗传价值的供体母牛重复取卵，从而获得遗传背景清楚的优 质卵母细胞，充分发挥良种牛的繁育潜力。 本项目是国际合作项目，与澳洲专家合作完成，时间上只安排了纯种母牛活体采卵两次， 其余优秀 F2 代种母牛采卵一次，笔者就本次所作的结果与本实验室长期屠宰采卵的培养结 果进行综合比较分析。为下一步活体采卵及体外培养提供有用的参考依据。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 日本 HONGDA 公司的活体采卵仪（HS-1500V 型超声波监视器，5.0MHz 阴道扇形扫描探头，60cm 采卵针，恒温槽，真空泵）卵泡液收集管 超净工作台(月坛，北 京) ；MCO - 17AI 型 CO2 培养箱(SANYO，日本) ；生物显微镜(OLYMPUS，日本) ；体视显 微镜(OLYMPUS，日本) ；移液器(Finnpipette，芬兰) ；24 孔板（Nunclon ，丹麦）；注射器 （BD ，上海）剪刀; PBS(Sigma) ;青霉素 (5000UI. ml-1 ，Sigma) 链霉素(5mg. ml-1，Sigma)； 照像摄像机(OLYMPUS，日本) 。 1.2 试验分组① 采卵频率分组，本单位将 12 头纯种雪龙黑牛进行每周采卵 2 次，51 头纯 种雪龙黑牛活体采卵 1 次。②将 16 头纯种雪龙黑牛在活体采卵前未注射 FSH ，其余每头牛 在采卵前第 3 天注射 90IU FSH，在采卵第2 天注射 30IU FSH 。 1.3 活体采卵方法 先将 PBS 液（Gibco ）放入恒温槽中39℃保温 。母牛站立保定，用6ml 2 ％普鲁卡因施行荐尾神经麻醉，根据牛体格大小肌肉注射静松林 1-3ml，待尾根松弛后再 进行操作。操作人员对牛进行直肠检查，并掏出直肠内牛粪，清洗外阴部，将带有采卵针的 探头插入阴道深部，到阴道穹隆后，根据所要穿刺的卵巢是左侧还是右侧而把探头放在穹隆 相应的一侧。术者一手在直肠把握卵巢，在超声波屏幕显示的卵巢卵泡图像的指导下，另一 手推动穿刺针穿刺卵泡。同时，用脚踏开关控制真空泵抽取卵泡液，真空泵的压力为 60～ 80mm 汞柱。从屏幕上看到卵泡立即塌陷，为了防止卵母细胞的流失，真空泵的启动应先 于穿刺进行。退出穿刺针，再对第二个卵泡进行穿刺，抽取卵泡液，直至该卵巢上 2mm 以 上的卵泡均被穿刺后再换另一卵巢，将采得的卵泡液用保温杯（32℃）带回实验室。用胚胎 收集滤杯过滤，卵母细胞留在滤杯中并反复冲洗几遍，在体视显微镜下检出卵母细胞，根据 卵母细胞胞质均匀程度及其周围卵丘细胞存在的状态将其分为 4 级。将优秀卵母细胞(A、B 级卵母细胞)放入培养皿中培养。 1.4 屠宰采卵 卵巢采自大连雪龙产业集团兼松屠宰场，F1 代母牛屠宰后，屠宰人员在 30min 内取下牛卵巢交给实验技术人员，实验技术人员将卵巢放入38.5℃灭菌的PBS （含有 -1 青霉素/链霉素）中保温带到实验室。反复洗涤 3 次后，用 5ml 一次性注射器、用 1UI.ml 18