理论课20眼科实验室检查演示文稿.ppt

3、常用PCR反应条件 高温变性/预变性（ 92℃～95 ℃ ） 低温复性（ 55℃～65 ℃ ） 中温延伸（ 72 ℃ ） * 4、PCR反应特点 　特异性强、灵敏度高、简便、快速、对标本的纯度要求低 　PCR反应的特异性决定因素为： 　　①引物与模板DNA特异正确的结合； 　　②碱基配对原则； 　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 　　④靶基因的特异性与保守性。 * 5、结果判断 取扩增产物10ul于2%琼脂糖（内含溴乙锭）凝胶上进行电泳30min，在紫外透射反射仪上观察结果，阳性者在特定位置出现橙黄色条带，阴性者在相应位置无条带。 * 6、应用举例 沙眼衣原体（沙眼病） 疱疹病毒（角膜感染） 地中海贫血基因检测 * 地中海贫血基因检测 引物 C1 5′-GTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCA-3′ C2 5′-TGCAGCTTGTCACAGTGCAGCTCACT-3′ C3 5′-GTGTACACATATTGACCAAA-3′ C4 5′-AGCACACAGACCAGCACGTT-3′ 引物由上海生工生物工程有限公司合成 * 地中海贫血基因检测 * PCR反应体系，总共25μl，具体如下 10×buffer缓冲液 2.5μl DNA模板 5.0μl dNTP （2.5m mol/L） 2.5μl Mg2+ （25m mol/L） 1.7μl 引物（包含上下游引物） （20μmol/L） 0.5μl 双蒸水 12.0μl DNA聚合酶（Taq酶） 0.8μl (1U/UL) ―――――――――――――――――――――――――― 25.0μl 扩增条件: 94℃预变性5min，然后93℃ 35s，55℃ 35s，70℃ 50s，共35个循环,最后置72℃延伸10min 。 地中海贫血基因检测 * 423bp 602bp 1503bp C1/2 PCR产物电泳图 C3/4 7、PCR反应影响因素 PCR反应的关键环节有 ①模板核酸的制备， ②引物的质量与特异性， ③酶的质量及， ④PCR循环条件。 反应五要素 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ * （二）实时荧光定量PCR * * TaqMan技术原理示意图 3’端的荧光Q分子吸收5’端荧光R分子的荧光信号 探针5’端连接的荧光R分子被Taq酶切割下来 荧光R分子发出荧光,切割的荧光分子数与PCR数量成比例 5’ 3’ 5’ 3’ Q R Q 5’ 3’ R 5’ 3’ 激发 5’ 3’ 5’ 3’ 激发 R Q 引物 Taq 酶 应用 多用于检测特定已知基因在生理或病理条件下的表达情况，如： 突眼病——外周血淋巴细胞中α-糖皮质激素受体与β-糖皮质激素受体的表达情况以及两者之间的比例关系，以指导是否采用糖皮质激素治疗。 * 应用 利用实时荧光定量PCR检测糖尿病大鼠视网膜中转化生长因子β受体-1和受体-2基因表达： 定量检测转化生长因子β受体-1（TβR 1）和转化生长因子β受体-2（TβR 2 )编码基因在糖尿病大鼠视网膜中不同时相点的动态表达水平，以探讨转化生长因子β及转化生长因子β受体在糖尿病视网膜病变（DR）中的作用。 * 三、核酸凝胶电泳技术 核酸（DNA或RNA）在碱性缓冲液中带负电荷，向阳极移动，在一定电场强度下，迁移率与其分子量成线性关系。 指示剂 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳 * 不同浓度PAG分离DNA片段的范围 PAG浓度（%） 分离DNA片段 溴酚蓝指示剂的迁移率 （相当于相应bp数的DNA） 3.5 100-1000 100 5.0 100-500 65 8.0 60-400 40 12.0 50-200 20 20.0 5-100 12 * 四、基因突变分析技术 已知点突变的检测 1.PCR结合限制性内切酶酶切片长度多态性分析（PCR