4猪重构胚胎体外生产技术研究.PDFVIP

4 猪重 构胚胎体 外生产技 术研究 4 猪重构胚胎体外生产技术研究 4.1 猪成纤维细胞和颗粒细胞的分离和培养 自体细胞克隆羊出生以来，核移植技术引起了广泛的关注。之后短短几 年内，又分别得到了小鼠、牛、山羊、猪和兔等多种动物体细胞克隆后代， 证明哺乳动物已分化的细胞也可以在卵母细胞质作用下发生重新编程，完成 直到个体的发育过程。鉴于体细胞克隆技术在动物繁殖和人类疾病治疗领域 的广阔应用前景， 与体细胞克隆技术相关的体细胞培养也日益受到重视。但 是目前， 关于体细胞培养方面的研究多侧重于细胞周期的控制和测定，很少 对体细胞的分离和培养进行研究，尤其是猪体细胞的研究则更少（Harrison ， Guidolin et al., 2002 ）。 本实验分别以猪的胎儿为材料，进行胎儿成纤维细胞的分离，并进行传 代培养和冷冻保存；同时用成熟培养后卵母细胞的颗粒细胞进行培养，为后 期猪体细胞核移植研究提供核供体细胞。 4.1.1 材料和方法 4.1.1.1 试剂与用品 本研究所用试剂除特别指明外，均购自 Sigma 公司。M199 和 DMEM 购 自 Gibco 公司；胰蛋白酶购自 Serva 公司；新生牛血清（NBS ）购自北京元 3.5cm 塑料皿购自 Nunc 亨圣马生物技术研究所；抗生素国产；四蒸水自制； 公司；玻璃平皿国产；核型分析试剂国产。 4.1.1.2 实验材料 屠宰后猪的胎儿（3 ～5 周龄）和猪的卵巢自屠宰场收集，实验材料置于 含双抗的生理盐水中运回实验室。 4.1.1.3 颗粒细胞的分离与培养 （1 ） 将 成 熟 后 的 卵 母 细 胞 转 入 1 mL 的 离 心 管 中 （ 有 1 mL M199 ＋ 10%NBS ），充分吹打使颗粒细胞完全脱落。 （2 ）用吸管把离心管中的培养液吸入检卵碗中，用吸胚管吸取卵母细胞， 转入另一个检卵碗中，剩下的培养液与颗粒细胞一起转入四孔板的孔中，置 4 猪重 构胚胎体 外生产技 术研究 于培养箱（37C 、5%CO 、饱和湿度）进行培养。 2 （3 ）2d 后（组织已贴壁），轻轻吸去原培养液，再缓慢加入2 mL 新鲜 培养液培养。 （4 ）以后每 2d 更换一次培养液，并观察细胞由组织块周边出现及生长 情况，至细胞铺满皿底时可进行继代培养。 4.1.1.4 猪胎儿成纤维细胞的分离 胎儿成纤维细胞用以下步骤分离： （1 ）将采集到的猪胎儿用含双抗的PBS （－）充分清洗5 次以上，去除 内脏，再用眼科剪充分剪碎。 （2 ）向剪碎的胎儿组织中加入 4 mL 含 0.25%胰酶和 0.04%EDTA 的 PBS （－）消化液，室温下消化，同时进行观察，发现在细胞培养液中出现大量微 小颗粒时，终止消化。 （3 ）加入4 mL 培养液（M199 ＋10%N