真核基因组DNA提取.pptVIP

提取RNA实验的关键 ___严格防止RNase的污染 核糖核酸酶(RNase): 催化降解RNA为小分子片段的核酸酶 无处不在 体内：取材要新鲜或液氮保存； 破碎细胞要快，尽量在低温下进行 体外：空气、试剂、耗材及实验者本身 体外RNAase的去除 ①所用的各种器皿：将玻璃器皿、离心管、吸头等浸泡于0.1% DEPC溶液中37℃下处理12 h，121℃高压灭菌30 min，再烘干。 ②配溶液时所用的超纯水需DEPC处理，即0.1% DEPC溶液配制后37℃放置12 h，121℃高压灭菌30 min；尽可能用未曾开封的试剂。 ③实验者本身：戴一次性干净手套、口罩，避免外界环境中RNA酶降解RNA。 ④仪器：70%乙醇拭擦。 RNA提取原理 商业化试剂盒（ RNAiso plus试剂、TRIzol reagent）中含有强变性剂（如异硫氰酸胍），能够充分裂解细胞，溶解蛋白质，使核蛋白与核酸分离。 再加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机下层（含有蛋白质、多糖、脂肪酸、细胞碎片和少量DNA），RNA存在于上清层中。 小心收集上清层后，经异丙醇沉淀即可回收得到总RNA。 高纯度的RNA，适用于Northern blot分析、mRNA纯化、RT-PCR和体外翻译等分子生物学实验。 注意 1. RNA浓度: RNA (mg/mL) = OD260×稀释倍数×40/1000。 2. RNA的纯度： OD260 /OD280 的比值在1.7~2.1较好， 比值较低，说明含有蛋白质污染 ； 比值太高，提示RNA有降解。 3. RNA电泳 可能是两种rRNA (28s和18s)，条带亮度比例约2:1。 条带弥散，说明RNA可能已降解。 若条带大小大于28s，则可能有基因组DNA的污染，用DNase I处理DNA污染较好。 DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子 重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次） DNA提取常见问题 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原因 对 策 A260/2801.8 材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融 尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融 问题二：DNA降解 对 策 原因 DNA提取常见问题 实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒 问题三：DNA提取量少 对 策 原因 DNA提取常见问题 实验原理 想要制备基因组DNA，必须破碎细胞膜，去除蛋白质、脂类和糖类等生物大分子且避免被细胞内核酸酶降解即保证DNA的完整性。 在EDTA（螯合二价阳离子以抑制DNase）存在的情况下，将分散好的真核生物组织、细胞用蛋白酶K消化真核细胞或组织并分解蛋白质， 用SDS溶解细胞质并使蛋白质变性从而与DNA分子分离，使DNA分子以可溶形式存在于溶液中。 DNA在高盐低pH的条件下，与硅基质膜特异性结合，在低盐高pH值条件下，吸附的DNA被洗脱下来。 实验步骤 处死小鼠，取肝脏20-50mg，剪碎，加入1.5mL离心管内 加入600 μL Lysis Buffer A，振荡混匀 加入10 μL 蛋白酶 K ， 60 ℃水浴1h， 其间颠倒混匀数次 1. 裂解组织细胞，变性蛋白，沉淀生物大分子 组织块尽量剪碎， 否则影响裂解及消化 主要含有 SDS（溶解细胞质并使蛋白质变性） EDTA（螯合二价阳离子以抑制DNase） 和Tris-HCl （缓冲体） 消化降解蛋白质 * 离心5 min，将上清转入离心柱中，静置2 min 加入10 μL RNase A，混匀，室温放置10 min 加入400 μL Lysis Buffer B，剧烈震荡30 s 核酸内切