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组织切片技术 组织切片技术是组织学、胚胎学、生理学、动物学等生物科学以及病理学、毒理学等医学基础学科研究观察细胞、组织的生理、病理形态变化的一种重要方法。 将组织固定、脱水、包埋等手段处理后，可以把组织切成极薄的片子，再用不同的染色方法染色，显示细胞、组织的形态，甚至细胞、组织内某些化学成分的变化。因此，组织切片技术是一项研究工作的重要技术。 组织石蜡包埋和切片技术 组织石蜡包埋和切片技术 一般步骤： 1 取材、固定 保存原有的形态结构 2 洗涤 洗脱固定剂 3 脱水 酒精脱水为透明做准备 4 透明 为透蜡包埋做准备 5 透蜡 为石蜡包埋做准备 6 包埋 为切片做准备 7 切片 一般6-10μm 8 贴片 9 染色 10 封片 冰冻切片技术 冰冻切片的种类较多, 有低温恒冷箱冰冻切片法, 二氧化碳冰冻切片法, 甲醇循环制冷冰冻切片法等。 一般步骤： 1 取材 2 冷冻切片 3 贴片 4 酒精固定 5 染色 6 封片 其它制片技术 整封法 小型材料如鸡胚、蛙胚，经固定、染色、脱水、透明、封片，保存。 涂片法 血液、精液、粪便等，经固定、染色、脱水、透明、封片，保存。 磨片法 牙齿、骨骼、介壳，磨片、封片。 浸渍分离法 利用药品使细胞间质溶解，细胞分离，取单细胞，染色、脱水、透明、封片，保存。 撕碎法 材料固定或浸渍到一定程度后，在解剖镜下撕开，取单个细胞或纤维染色、封片。 压碎法 柔软的材料，玻片间压碎，染色、封片。 组织石蜡包埋和切片技术步骤 （一）材料的采集与分割 采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后进行分割固定）。为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。分割时动作要迅速。分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。? （二）杀死与固定 杀死动物的方法很多，但不论哪种，都要尽力避免动物产时间的陷于痛苦和濒于死亡状态，以免使动物的组织细胞成分结构发生变化，或引起病理假象。 动物杀死后应立即取材固定，以免招致会因失水变形或死后组织变化，组织自溶自组织死亡后就会开始。 固定，就是将新鲜的材料从个体上取下后立即投入固定剂中，借助化学药品的作用使细胞、组织的形态结构保存起来，不使其改变形态或变性。 固定的意义： 防止组织溶解和腐败 使细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等成分沉积保存下来，保持原有的结构与生活时相仿。 因沉淀及凝固的关系，使细胞内成分产生不同的折射率，使的细胞结构变得清晰起来，而且容易染色。 固定剂兼有硬化作用，增加组织硬度，便于后处理。 固定剂的选择 可用于固定剂的药品应符合下列条件： 具有很好的穿透性。 具有快速的渗透力。 不会改变组织形态结构。 使细胞内的成分凝固或沉淀。 增加细胞的媒染作用和染色力。 使组织适度硬化，易于切片。 有保存作用 常用固定剂的性质及使用 固定剂有单纯固定剂和混合固定剂之分。 单纯固定剂 甲醛（福尔马林）溶液：市售的为40%甲醛含量。使用时稀释为10%即可。 特点：渗透力强，但在随后酒精脱水过程中收缩很大；不能使蛋白及核蛋白沉淀，对神经、髓鞘固定很好，可固定线粒体、高尔基体。可保存组织。 乙醇 95%，或100%。 特点：可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白。酒精固定的标本对核的染色不良，原因是酒精固定的核蛋白易于溶于水。 穿透速度快，硬化显著，放置过久会发脆，组织收缩厉害。 70%酒精可长期保存材料。 乙酸 5% 特点：不能沉淀白蛋白，球蛋白，但能沉淀核蛋白，所以染色质固定很好。 穿透性很好，一般组织只需固定1小时。组织不会硬化。 缺点：组织易膨胀。 苦味酸（picric acid）强酸 特点：易溶于酒精、二甲苯、水，可沉淀一切蛋白，成为不溶于水的蛋白结合体，但对脂类无作用。 穿透速度较慢，使组织收缩显著，一般不单独使用。 4％多聚甲醛溶液 进行免疫组织化学方法研究时常选用该固定液。动物灌注固定及后固定（动物器官经该液灌注后，然后取材，再用该液浸泡2-24小时）也常选该固定液固定。 可用于培养细胞的固定。 胚胎材料的固定。 单独用多聚甲醛固定的细胞不能使抗体进入细胞内，因此,标本固定后必须用非离子去污剂(triton-x?100)透化标本。? 4％多聚甲醛溶液（PFA）配制 称取40gPFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60-65℃,使成乳白色悬液。用1.0mmol/L?的NaOH调PH至7.0使呈清亮状（滴加），再加入约