H5N1亚型禽流感病毒HA基因在马立克病毒上重组体地构建.pdfVIP

河北农业大学硕士学位(毕业)论文 马立克病毒是复杂的大分子DNA病毒，其弱毒株也可和鸡痘病毒(FPV)一样作为病毒载 体来表达外源基因。但由于MDV为细胞结合性疱疹病毒，在筛选、纯化重组病毒时操作难度较 Tsukamoto等将IBDV的Vt2基因在MI)VCV]988中表达并获得同时对MD、IBI)的强抵抗力。 抗有母源抗体的新城疫(ND)和马立克氏病(MD)的有效保护印I。 1．2实验总体思路和研究的目的及其意义 国内外的禽流感防治实践表明：疫苗免疫是防止禽流感暴发和造成巨大损失的主动措施、关 键环节和最后；舅线。疫苗免疫工作傲到位了，才能更努的舫』j=禽流感进一步在动物中的流彳亍，更有 利于人民生活质量的提高和社会的稳定发展。本研究着重于选择一个高效的可刺激机体免疫系统 产生免疫力的禽流感目的片既与一个台适的载体相连，构成～个可用于禽流感疫苗研发的重组质 粒。 1．2．1选择禽流感病毒H^基因作为表达基因 就AIV而言，具有免疫保护性的蛋白主要是HA基因，主要诱导机体产生中和抗体．为体液免 疫的主要靶抗原，它们是亚型特异性的。据报道基于HA基因的话载体疫苗、亚单位疫苗或核酸疫 苗均可对同一HA基因亚型病毒的攻击产生近100％的保护，而对其它亚型病毒攻击的保护性较 差。 AIV的基因组由8个单股RNA片段组成，这种多节段性的特点决定了基因组除本身易发生 基因突变、小片段基因重组外，还特别易与另一禽流感病毒、猪流感病毒或人流感病毒等进行完 整片段的基因重排，，因而AIr亚型众多和变异性极强∞39“o”】。自1878年，意大利首次报道 禽流感发生以来，禽流感相继在世界各地暴发，而且不断出现新的亚型和变异株，以致于1997 年香港及2004年南亚地区发生了感染人的事件。我国自1993年在鸡、鸭、鹅、鸽、珍禽中分离 到AIV以来，鸡群中已存在H9、H5、H7及H14等多个血清亚型，给我国养禽业构成极大威胁。 因此加强禽流感疫情监测工作特别重要，尤其是定期、持续、监测和及时、准确的预测预报，只 有如此，才链将禽流感尤其是高致病力禽漉感消灭在萌芽状态。 HA基园是构成AIV囊膜纤突的主要成分之一，在所有的AIV蛋白中最为重要，分子量为7．5 万的糖蛋白m】。HA基因是AIV基因组中变异最大的基因AIv的抗原性和致病性很大程度上取 决于该基因的变异情况。 HA基因在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用，不但可刺激机体产生中和抗体来中和病毒的感 染力，而且HA基因诱导机体产生的体液免疫反应，对宿主抵抗禽流感起到了决定性保护作用 黔“，蛞：使目前研翩HA基因工程疫苗成为AIV疫苗的研究热点p6r哪删。 1．2．2选择马立克病毒的基因作为表达载体 八十年代以来，MDV超强病毒株(VVMDV)的出现促使火鸡疱疹病毒但V帅马立克病 2 HSNl亚型禽流感病毒HA基因在马立克病毒上熏组体的构建 I型。 其中包括一些MDVl型弱毒株如CVl998也被广泛使用删。本研究使用的MDV就是MDV 就实验病毒而言，其在抗原性上几乎与流行毒株完全一致，因而从理论上讲比其它两型血清型应 能更有效地诱发免疫应答[5L52]。MDV血清l型毒株通过系列传代可以致弱，突变发生在基因组 的许多部分，失去gC(A抗原)以及132个碱基对重复片段增加。最终导致在鸡群中繁殖能力降低， 致病性降低。研究表明病毒在体内繁殖和水平传播中gC走一定作用，针对gC两产生的免疫应答 反应很可能形成保护性免疫。因此，用失去gC的弱毒苗是不可取的吲。因为缺乏对毒力致弱机 理的了解，以及如何达到致弱过程，失去致病性又获得理想的保护效力的平衡方面还存在困难，所 以需要考虑新的预防接种方法。重组疫苗的优点在于能够表达MDVI型抗原丽使其不具有残留 致病性，并通过在鸡胚成纤维细胞中连续传代获得弱毒疫苗；能够在免疫预防MDV的同时，也能 免疫预防禽流感等一些禽病；免疫原性能够通过真空冷冻干燥法保持[54,55舯I。 MDV的基因组主要分为US区和UL区，业已证实，MDV的US区有多个基因插入位点 长的非必需基因，在US基因中插入外源基因片段不会影响病毒的复制【57’5”。本研究从US区中 因。与已经测序的另外两个MDV et et al，1991；Brunovskis 1型特异性