分子生物学实验设计-蚕豆病.pptVIP

蚕豆病简介 蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。  红细胞膜的破坏 还原型谷胱甘肽 体内重要的抗氧化剂 保护红细胞膜蛋白的完整性 生理盐水、溶血素 、3.8mmol/L NADP 、0.5mol/L Tris缓冲液（pH7.5） 、0.63mol/L氯化镁溶液 、33mmol/L G-6-P液 紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管 主要试剂和仪器 试剂： 仪器： 实验流程 取抗凝血2ml，生理盐水洗涤红细胞3次（1500r/min离心 10min） 除去上清液和乳白层（白细胞和血小板） 加等体积生理盐水→红细胞悬液 红细胞悬液0.05ml+溶血素0.5ml，混合，放置10min → 溶血液 并测定其Hb浓度 进行比色 （见下表） G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法 ) 试管 对照管 测定管 NADP液（ml） 0.1 0.1 Tris液（ml） 0.1 0.1 氯化镁液（ml） 0.1 0.1 蒸馏水（ml） 0.68 0.58 G6P液（ml） — 0.1 37℃预热 溶血液（μl） 20 20 立即340nm处测吸光度，以对照管调零，37℃恒温，每分钟观察1次，记录吸光度的变化 计算公式：G-6-PD活性（U/gHb） =△A/min×1000/6.22×1020/20× Hb(gL-1) △A/min:每min吸光度的平均变化值 1000/6.22:为微摩尔消光系数 1020/20:总容量与溶血液的量之比； 注意事项 1、急性溶血期后2~3个月再查或复查G6PD活性 2、最好同时作阴性对照和阳性对照（影响因素多） 3、离心沉底后应取底层红细胞测定 G6PD活性 结果分析 G6PD缺陷者： G6PD活性较正常平均值低40%以上即可作出诊断 方法 正常值范围 WHO推荐的Zinkham （12.01±2.09) IU/gHb(37℃) ICSH推荐的Glock与McLoan法 （8.34±1.59）IU/gHb(37℃) NBT定量法 （13.1~30.0）NBT单位 Chapman和Dern法 （2.8~7.31）IU/gHb(25℃) 根据实验结果 该男孩患蚕豆病 3.从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。 ①细胞膜的破坏 ②胆红素的异常  红细胞膜的破坏 葡萄糖磷酸戊糖途径 葡萄糖 6 – 磷酸葡萄糖 5 – 磷酸核糖 NADPH + H+ 磷酸化 5 – 磷酸核糖 磷酸戊糖途径 NADPH + H+ 5 – 磷酸核糖 NADPH + H+ 5 – 磷酸核糖 NADPH + H+ 5 – 磷酸核糖 NADPH + H+ NADPH维持GSH(谷胱甘肽）的正常含量和还原状态 G6PD (6 – 磷酸葡萄糖脱氢酶）起关键作用 * * * * * * * ★年级、专业、班级： ★实验课时间： ★实验室： ★组别：第一组 ★组员： ★报告人： 案例： 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。 临床表现： 体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未