慢性应激抑郁型黄褐斑动物模型建立与现有模型的比较研究.docVIP

PAGE PAGE 1 慢性应激抑郁型黄褐斑动物模型建立与现有模型的比较研究 　　[摘要]目的：建立并验证慢性应激抑郁型黄褐斑动物模型，并与现有其他模型进行比较。方法：在注射黄体酮同时，进行慢性轻度不可预见的应激刺激，并紫外线局部照射。结果：黄体酮+紫外线+慢性应激抑郁法造模较其他方法更能导致皮肤丙二醛（Malondialdehyde，MDA）升高和超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）降低以及皮肤黑素细胞的增加，并且具有抑郁症的行动学表现。与空白组比较，经慢性轻度不可预见性应激刺激的动物体重显著下降，敞箱试验中穿格次数、理毛时间和次数、直立次数得分显著下降，液体消耗试验中糖水消耗和糖水偏爱百分比明显下降，而纯水消耗显著提高。结论：黄体酮+紫外线+慢性应激抑郁法建立的抑郁型黄褐斑豚鼠多因素模型获得成功。与现有其他模型比较，其皮肤MDA、SOD与皮肤黑素细胞等客观指标的变化也更加接近人类黄褐斑的病变。 　　[关键词]黄褐斑；抑郁症；动物模型 　　[中图分类号]R758.4+2[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2013）03-0349-06 　　黄褐斑是临床的常见病之一，近年来国内外学者尝试运用激光[1]和强脉冲光治疗黄褐斑取得了一些进展，为黄褐斑的治疗来了新的契机[2-3]。但激光照射对人表皮黑素细胞生物学的影响却并不十分清楚。基础研究显得尤为重要，使得黄褐斑的动物模型的研究成为非常重要的课题。查阅以往关于黄褐斑的动物模型研究文献，国内外均有报道，主要以小鼠局部紫外光照射[4-5]、内用雌激素全身攻击[6]、微量定点注射辅以紫外线照射[7]等方法进行造模，由于黄褐斑是多因素致病机理而产生，单一因素造模法建立的动物模型代表性比较差。综合其诸多因素的考虑，笔者通过紫外线照射、雌激素全身攻击、慢性轻度不可预见的应激刺激建立黄褐斑实验动物模型。 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　1.1.1动物：健康纯白色雌性豚鼠60只，清洁级，体质量（280±12）g，随机分为5组，每组12只，由深圳市人民医院实验动物中心提供。 　　1.1.2实验药品和试剂：黄体酮注射液1ml：20mg（上海通用药业股份有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、酪氨酸（Tyr）检测试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；HMB45（melanoma黑素瘤）鼠抗人单克隆抗体即用型试剂盒（福建迈新公司）；中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）。 　　1.1.3实验器材：紫外线照射灯（UVB，德国Waldmann）；UV2401PC紫外分光光度计（日本岛津公司）；CMIAS多功能真彩色病理图像分析系统2000型（空军总医院与北京航空航天大学共同研制）。 　　1.2动物造模方法：造模时间28天。①空白组：以10%NaS2水溶液背部脱毛，每周脱毛一次，背部裸露约2.0cm×2.0cm面积皮肤1块；每天肌肉注射注射用水，5ml/kg体质量；②紫外线组[4]：同正常组脱毛处理，每日以波长为320nm的中波紫外线（UVB）照射豚鼠背部皮肤1次，照射时间30min，动物与光源的距离为20cm；③黄体酮组[6]：同正常组脱毛处理，每日8：00～9：00交替于豚鼠两后腿肌肉注射0.4%黄体酮，5ml/kg体质量；④紫外线+黄体酮组：同正常组脱毛处理，紫外线照射方法和黄体酮注射方法同紫外线组和黄体酮组；⑤紫外线+黄体酮+慢性应激抑郁组：同正常组脱毛处理，紫外线照射方法和黄体酮注射方法同紫外线组和黄体酮组。同时进行慢性轻度不可预见性的应激抑郁豚鼠模型方案：按照文献[8-9]并略加改进，将明暗颠倒24h、2h行为限制、停食24h、停水24h、夹尾1min、40℃水中游泳5min、电击足底5s（30伏电压）、摇晃5min（160HZ）、40℃环境5min共9种刺激随机安排到28日内，每日1种，每种刺激出现2次，使动物不能预料刺激的发生，同种刺激不能重复出现。 　　1.3测定指标与方法 　　1.3.1皮肤黑素细胞的病理形态学观察：取豚鼠明显的色变去毛皮肤1块（0.2cm×0.2cm），10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。再经脱蜡至水化、抗原修复后，用HMB45（melanoma黑素瘤）为第一抗体，DAB显色，苏木素复染。用PBS代替一抗做阴性对照。 　　1.3.2显微镜图像分析[10]：采用病理图像分析系统对目标图像进行定量分析，随机选择每张切片在显微镜物镜400X下5个不重叠视野进行彩色图像采集与存储，计算出每个视野中的目标个数、阳性目标面积、平均灰度值与平均光密度值等。 　　1.3.3MDA、SOD及酪氨酸活性测定：切取脱毛部位皮肤0.2g，用预冷生理盐水（4℃）冲洗，除尽杂质，拭干，分别放入有2.