基因工程课件研究生.pptVIP

基因工程主要操作技术 以某一已知基因（如：CFL2基因）为例。从基因的结构到基因的功能研究所应用的分子生物学方法 第一部分 已知目的基因的获取 —PCR技术方法 二、 PCR体系组成 DNA提取（酚-氯仿提取法） 引物设计（primer 5.0） A基因扩增的引物设计步骤 在GenBank数据库中找到A基因的序列，找到需要目的扩增的区域 三、PCR反应体系 基本原理： DNA和RNA为多聚阴离子，在电场中向正极方向迁移。电泳迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量小的DNA分子构型更紧密，迁移的速度更快。 一、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖为线性多糖聚合物，加热煮沸后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，密度由琼脂糖的浓度决定。 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 作用原理 ：聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应。 三、琼脂糖电泳与聚丙烯酰胺电泳的区别 第三部分 PCR产物的回收纯化 技术指标 纯度和回收率 DNA回收原理 第四部分 DNA的克隆与测序分析 克隆的目的：以繁殖DNA片段为目的，使外源外源基因能在宿主细胞中大量的复制扩增。用于保存目的片段或者测序。 DNA克隆的关键 克隆载体：携带外源DNA进行自我复制 宿主细胞（感受态）：携带外源DNA的扩增 质粒提取：扩增的宿主细胞内DNA的还原 克隆载体 克隆载体一般是原核细菌，将外源基因与克隆载体的质粒相连接 在导入原核细菌内 ，质粒会在原核细菌内大量复制形成大量的基因克隆，被克隆的基因不表达 但一定被大量复制。 载体的一般结构 TaKaRa 公司pMD18-T 载体 T-A克隆原理 质粒在大肠杆菌中的增殖 阳性克隆子的筛选 a-互补 原理 质粒提取的原理： 微量碱变性法 商品化的质粒抽提试剂盒 第五部分 基因的表达分析 方案： 构建真核基因表达载体 表达分析 克隆载体 以繁殖DNA片段为目的的载体。载体能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。 表达载体 具有克隆载体的基本元件 还具有转录/翻译所必需的DNA顺序。能够带动外源基因在宿主细胞中进行表达。 载体的一般结构 表达载体 与克隆载体的区别 克隆载体 Ori——AMP——MCS 原核表达载体 Ori—AMP—MCS—promoter—SD—终止信号 真核表达载体 Ori—AMP—Orie—MCS—启动子(P)/增强子(E) —终止信号—加尾信号PloyA 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 表（达目的基因） 载体构建（定向克隆）的工具 “基因剪刀”——限制性内切酶 “缝纫机，浆糊”——连接酶 “交通工具车子”——载体 限 制 性 内 切 酶 在特异位点上切割DNA分子 ，分三类，常用为Ⅱ类酶， 识别序列呈回文对称 T4 DNA Ligase T4链接酶是由T4噬菌体的基因编码，是一个487个氨基酸组成的单体蛋白质，能催化相邻DNA链的5’-P末端和3‘-OH 末端以磷酸二酯键结合的反应，需要ATP作为辅酶，可以催化粘性末端之间或者平端之间的DNA链接，也可催化DNA和RNA之间及少数RNA之间的连接。 基因克隆时是定向插入 插入序列两边的酶切口不同,插入的组件不会倒装，保证了在其下游目的基因插入后，沿5’→3’方向正确转录，这种构建方式称为定向插入。 能正确读出三联体密码的起始序列 插入序列自身含ATG起始密码,那么本身的编码蛋白不能改变，3个一组进行读码。如果有Tag蛋白，要保证下游的Tag蛋白也能够正确读码。如果不能正确读码，要在酶切位点后加入保险序列。 即：要保证插入蛋白的正确编码，如果是融合蛋白，也要保证融合蛋白的正确编码。 NCBI上查找CFL2基因编码序列 猪CFL2基因编码区序列 ATGGCTTCTGGAGTTACAGTGAATGATGAAGTCATCAAAGTTTTTAATGACATGAAAGTAAGGAAATCTTCTACACAAGAAGAGATCAAAAAAAGAAAGAAAGCAGTTCTCTTCTGTTTAAGTGATGACAAAAGACAAATAATTGTAGAGGAAGCAAAGCAGATCTTGGTGGGTGACATTGGTGATACTGTAGAGGACCCCTACACATCTTTTGTGAAGTTGCTACCTCTGAATGATTGCCGATATGCTTTGTACGATGCCACATACGAAACAAAAGAGTCTAAGAAAGAAGACCTA