辛伐他汀对人牙髓干细胞增殖和分化的影响.docVIP

PAGE PAGE 1 辛伐他汀对人牙髓干细胞增殖和分化的影响 　　[摘要]目的：研究辛伐他汀对人牙髓干细胞（dentalpulpstemcells，DPSCs）增殖和成骨分化的影响。方法：将第3代人DPSCs在矿化培养液中诱导培养，同时加入不同浓度的辛伐他汀（1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L），噻唑蓝（methylthiazolyltetrazolium，MTT）法检测细胞增殖情况，碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）活性，茜素红染色鉴定成骨分化。结果：各浓度辛伐他汀均抑制人DPSCs增值，辛伐他汀浓度为1×10-5mol/L时，抑制作用最明显。适宜浓度辛伐他汀（1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L）促进人DPSCs向成骨细胞分化，其中，1×10-7mol/L的辛伐他汀促进ALP活性的作用最明显。结论：辛伐他汀抑制人DPSCs的增值，适宜浓度的辛伐他汀可有效促进人DPSCs的成骨分化。 　　[关键词]辛伐他汀；牙髓干细胞；增殖；分化 　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2013）02-0263-04 　　辛伐他汀是脂类代谢途径中的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeAreductase，HMG-CoA）还原酶的抑制剂，临床常用于降低胆固醇、降低血脂，减少心脏病的发生[1]。1999年Mundy在Science发表文章，报道辛伐他汀在骨代谢方面的影响，其实验研究发现，辛伐他汀可显著增加成骨细胞数量，减少破骨细胞数量，促进松质骨骨量增加，证明辛伐他汀具有良好的促进骨修复的性能[2]。此后，国内外学者也通过多项实验证实了辛伐他汀的促成骨分化特性。但以往的研究表明，不同的他汀类药物对不同类型的细胞，其增殖效应是不同的。他汀类药物可能抑制平滑肌细胞和内皮细胞的增殖，但却可以提高成纤维细胞的有丝分裂活性。故本实验采用噻唑蓝法、碱性磷酸酶活性检测、茜素红染色等多种方法，研究辛伐他汀对人牙髓干细胞增值及分化的影响。 　　1材料和方法 　　1.1主要材料：胎牛血清（Hyclone，美国）；DMEMF/12（Gibco，美国）培养基；3mg/mlⅠ型胶原酶（Gibco，美国）；0.25%胰酶（碧云天生物技术研究所，上海）；青链霉素（碧云天生物技术研究所，上海）；PBS缓冲溶液；100μmol/L抗坏血酸（sigma，美国）；10mmol/Lβ-甘油磷酸钠（sigma，美国）；2mmol/LL-谷氨酰胺（sigma，美国）；茜素红（Sigma，美国）；碱性磷酸酶试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京）；噻唑蓝（Amresco，美国）；辛伐他汀（sigma，美国）；二甲基亚砜（sigma，美国）；TritonX-100（碧云天生物技术研究所，上海）。 　　1.2人牙髓干细胞分离培养及传代：选择哈尔滨医科大学附属第二临床医院口腔外科门诊采集的因正畸拔除的正常前磨牙或阻生的正常第三磨牙（患者14～25岁），所有成年患者及未成年患者家属均知情同意。依据GronthosDPSCs原代细胞培养法[3]，劈开实验牙，用镊子取出牙髓，含双抗PBS充分冲洗，置于体积分数为0.3%的Ⅰ型胶原酶和0.4%的分散酶（1：1）37℃横湿振荡器内消化1h，200目尼龙筛过滤悬液至10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入含20%FBS培养基，吹打混匀，血球计数板计数以1×108个/L细胞接种至50ml培养瓶，37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。每周换液两次，细胞融合达80%后，0.25%胰蛋白酶消化，1∶2比例传代。 　　1.3DPSCs鉴定：克隆团分选技术将DPSCs悬液进行纯化分离，流式细胞技术鉴定DPSCs，倒置显微镜观察细胞形态，细胞常规传代至第3代用于后续实验[4-5]。 　　1.4MTT染色实验：将DPSCs以5×103个/孔接种在九十六孔板中，在37℃、体积分数为5%C02饱和湿度条件下，于矿化培养液中（DMEMF/12培养基、胎牛血清、青链霉素、100μmol/L抗坏血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，2mmol/LL-谷氨酰胺[6-7]），分A、B、C、D、E五组，加入不同浓度辛伐他汀，进行细胞培养。各组辛伐他汀浓度为A组：1×10-5mol/L；B组：1×10-6mol/L；C组：1×10-7mol/L；D组：1×10-8mol/L；E组：0mol/L。于细胞培养第3天加入MTT20μl，37℃孵育4h，吸去孔内培养基，每孔加入二甲基亚砜150μl，培养板均匀振荡10min，自动酶标