培养细胞的检测指标.ppt

支原体污染 最常见、不易察觉 大小介于0.2-2 μm，约1%可通过滤菌器 对酸耐受性差，对热较敏感，青霉素无效 “正常”感觉 腺苷酸环化酶 精氨酸 检测 ◆支原体检测: 支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰DNA的复制，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。 支原体检测方法和处理 1）荧光技术检测：支原体含有DNA，能与一种荧光染料Hoechest 33258特异性的结合，可根据细胞表面的荧光来显示细胞是否污染有支原体。 2）直接培养法：实验室常用。 3）放射自显影检测： 4）DNA分子杂交： 检测完毕后，所有实验用具均应经过高压消毒处理 支原体污染电镜照片（×30K） 病毒的污染及检测 1）致细胞病变效应（Cytopathic effect, CPE）或集落的检测：采用相差显微镜检测 2）血细胞吸附试验； 3）鸡胚接种。 细胞间交叉污染 为避免细胞间交叉污染，应注意： ◆了解各细胞系的特征； ◆培养各细胞系的操作手续要快速； ◆培养各细胞系不用同一瓶的培养液和酶等； ◆吸过培养液和细胞悬液的吸管，不能放回储存培养液和酶的瓶内； ◆经常检查培养物特征，注意任何突然的形态学改变，通过染色体或同工酶谱分析，检查是否有交叉污染。 三、污染的预防 消毒(Sterilization) 无菌操作(Aseptic technique) 四、污染的排除 ： 抗生素处理： 加温除菌：支原体热耐受性差，可把污染的细胞41度处理5～10 小时，以杀灭支原体，但对培养细胞本身也有很大影响。 共培养法：从动物腹腔采集巨噬细胞，与污染细胞共培养。 重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释后传代，每周换2次含抗生素的新鲜培养液，4～5周后，重复克隆2次。 动物体内接种除菌法：受支原体污染的肿瘤细胞可接种到动物皮下或腹腔中，借助动物的免疫系统杀灭支原体。 裸小鼠（nude mice）：T淋巴细胞功能缺陷动物 即先天性无胸腺裸小鼠，由11号染色体上nu隐性基因突变导致。 被毛生长异常，呈裸体外表。 无胸腺，仅有胸腺残迹或异常胸腺上皮，不能使T-cell正常分化，导致细胞免疫力低下。幼龄鼠有残存的未分化的上皮细胞。 B细胞功能正常，NK细胞活力增强。 繁育能力差，乳腺发育缺损，以雄性纯合子与雌性杂合子繁育。 T细胞缺陷可通过移植成熟T细胞、胸腺细胞或正常胸腺上皮得到校正。 Summary 细胞培养操作中如何避免污染？ 各种污染的鉴定和处理？ 培养细胞死活的鉴定方法？ 培养细胞的观察方法和增殖活力的测定方法？ * 复习：消毒与灭菌 * 相差显微镜由相差聚光器和相差接物镜两个主要部分组成。它与普通光镜相比多了两个部件，一个是在聚光器上增加一个环形光阑，使透过聚光器的光线形成空心光锥、聚焦到标本上。另一个是在物镜的后焦面增加一个相板，相板有一个环形区，其大小恰好通过环形光阑束的直射光，相板各区镀以不同物质，使得通过环形区的光比通过相板其他部位的光超前或滞后1/4λ * 细胞培养技术是手段，不是目的；其目的是： 细胞数/毫升细胞悬液＝4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数 1毫米 计数原则： 不数死细胞（染蓝）、压线细胞数上不数下，数左不数右，一团细胞按一个计数！ 视频：细胞计数.wmv 1毫升＝1立方厘米 2. 细胞生长曲线 如何作？page73 三、培养细胞的检测指标 ◆ 生长曲线是培养细胞生物学特性的基本参数之一，是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标。 ◆ 常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响！ 3. 细胞分裂指数 细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标。它以被测1000个细胞中的分裂细胞数来计算。其方法为：用秋水仙素将细胞处理1～2小时后，按染色体制片法制片并染色，计算1000个细胞中分裂相的数目，重复4次取平均值，用百分比表示。 三、培养细胞的检测指标 基本步骤： (1)细胞准备 用盖片(支持物)培养法。 (2)每24小时取出一个小玻片，按常规方法进行固定，吉姆萨或HE染色，封片，制成永久标本。 (3)显微镜下选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞并计数。逐个视野进行，对每一时间组的玻片各取细胞多、中、少3个区域各一区，共数1000个细胞，计算出平均分裂相值所占百分比。观察时要掌握好分裂相标准，主要是确定好划分间期和前期，末期和间期等的界限，以减少误差。 细胞分裂指数=细胞分裂相数/细胞总数(1000)×1000 4. 细胞贴壁率 细胞贴壁率又称细胞接种存活率。它是细胞被制成分散的悬液后，以低密度(2～5个细胞/cm2)被接种到底物上，贴壁并能