细胞培养汇总.ppt

3、为何培养基保存于4 °C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？ 培养基保存于4°C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH 值。 4、培养细胞生长减慢可能原因： 由于更换不同培养液或血清 比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验 增加起始培养细胞浓度 培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏 让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培养液。补加谷氨酰胺或生长因子 培养物中有少量细菌或真菌污染 用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。 试剂保存不当 血清需保存在-5℃ 到-20℃。培养液需在2－8℃避光保存。含血清完全培养液在2-8℃保存，并在2 周内用完 5、培养细胞不贴壁 胰蛋白酶消化过度 缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度 支原体污染 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物 培养液中无贴壁因子 6、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？ 欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡 7、培养液pH 值变化太快 CO2 张力不对 按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5％ 到10％ 改用不依赖CO2 培养液 培养瓶盖拧得太紧 松开瓶盖1/4 圈 NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足 加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度 培养液中盐浓度不正确 在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液 细菌、酵母或真菌污染 丢弃培养物或用抗生素除菌 8、培养液出现沉淀，但pH值不变 用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来 用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌 冰冻保存培养液 将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液 9、培养液出现沉淀，同时pH 发生变化 细菌或真菌污染 丢弃培养物 抗生素除菌 10、原代细胞培养物污染 原代培养组织在进入培养前已污染 培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织 11、支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？ 不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。 如有支原体污染，直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 * 由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果 * 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液 * 死细胞的细胞膜通透性发生改变，染料可大量进入却不能被排出，因而细胞被染色；而活细胞能排出细胞内的染料，因而不易着色。 0.4%台盼兰染液配制： 台盼兰 0.4克 加双蒸水至100 ml. * 一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。 * 由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常 正常细胞的G1/ G0 期具有二倍体细胞的DNA 含量(2N) ,而 G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S 期的DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。因此,通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA 含量进行检测时,可以将细胞周期各 时相区分为G1/ G0 期,S 期和G2/ M 期,并可通过特殊软件 计算各时相的百分率。值得注意的是, PI 不能通过细胞膜 完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时,必 须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI 进入细胞内与细胞内的核酸结合。乙醇通常为终浓度为 70 %的冷乙醇。 * * 是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 * 不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。 * 前散射光