基因工程LYL.docVIP

1.基因工程的定义： (1).将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作称为基因工程 基因工程包括基因的分离、重组、转移以及基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程。 (2).基因工程（genetic engineering）也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。一般说来所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞中内，而能持续稳定的繁殖。 2.基因工程的实施至少要有四个必要条件:工具酶,基因,载体,受体细胞 3一般认为1973年是基因工程诞生的元年（S. Cohen等获得了卡那霉素和四环素双抗性的转化子菌落)理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。 4. 理论上的三大发现 （1）、DNA是遗传物质被证实1944年，Avery O.T.利用肺炎双球菌转化实验 （2）、DNA的双螺旋结构和半保留复制机理 （3）、“中心法则”和“操纵子学说”的提出三联体密码子系统的建立 5,限制性内切酶(restriction endonuclease)这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。 限制性核酸内切酶的发现： 限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。 II型限制性核酸内切酶的基本特性： a. 识别位点的特异性识别靶序列是唯一的，通常是由4～8个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。 b. 识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称的结构，以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列切割序列呈典型的旋转对称型回文结构(palindrome) c. 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 d. 核酸内切酶作用后的断裂方式 粘性末端 ：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。 平末端: 两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。 6,.星号活性:在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性。用*表示。 7. 连接酶的来源 1. DNA连接酶： 大肠杆菌染色体编码的 2. T4 DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的 DNA连接酶 －－NAD+ T4 DNA连接酶 －－ATP 8. 体外连接的三种方式： 1. 用ＤＮＡ连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断 2. 用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将平末端的DNA片断连接；或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)- poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ连接酶连接。 3. 先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ连接酶连接. 9. ＤＮＡ连接酶： 能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（ OH ）和5 只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。 限制片断的末端连接作用 分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。 分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。 Ｔ４ＤＮＡ连接酶（DNA ligase） 该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。 DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。 影响连接酶作用的因素 1. 反应温度： 连接缺口的温度：37度 连接粘性末端的最佳温度： 4～15度 2.Ｔ４ＤＮＡ连接酶的用量： 平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。 粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。 ATP的用量10μmol~1mmol/L之间 3. 提高外源片断与载体的浓度的比值，（10～20倍） 10.合成cDNA的主要步骤： 1、应用poly(A)mRNA为模板，以12~18个碱基长的oligo(dT)片断作为引物，加入