实例图解简并引物设计.pptVIP

实例图解简并引物设计;三、基本原则 设计一对好的引物，归结起来就是 5′端引物、3′端引物之间以及两者与模板的关系处理得恰到好处： 两引物的序列要与模板的序列紧密互补； 两引物不能在模板的非目的位点发生错配； 两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。 四、延伸原则 引物长度：常用为 18-27bp，最大不可超过 38bp，否则容易导致延伸温度过高，不适合 DNA 聚合酶反应； GC 含量：一般介于 40%-60%之间，且两个引物之间的 GC 含量相差不能过于悬殊； 碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的 GC，GC 富集区容易导致错误引发反应。;五、特别注意;六、设计流程;七、示例背景;八、详细图解;先将光标定位在第一条序列任意位置，然后在左下角Site处直接输入CP 基因上游分界点位置（8391）后回车。接着点击“Speicaes/Abbrv”和8391 那一列的交界点时按下键盘上“Shift”不放，移动光标到“1”那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删除冗余序列。;;2. 引物设计;PS：是否位于密码子的第3 位，可以通过“Tranlated Protein Sequences”-“DNA sequences”切换查看，如右图，CP 基因的末端3 个碱基是终止密码子所在的位置，A 是第三位密码子。;（2）生成 Seq Logo 选定序列后，参考上述步骤，删除冗余序列，保留CP 基因3‘端序列，同样导出为Fasta文件，将序列粘贴入Web Logo3的文本框内或直接上传序列文件，设置相关参数后点击“Create”生成 Seq Logo 格式的文件CP-3.fas。 参数设置： “Output format”（输出格式）推荐用“PDF”，“Color scheme”（颜色方案）推荐用“Classic (NA)”，设置完毕，点击右下角“Create Logo“即可得下图的Seq Logo 格式文件。;通过Web Logo 生成的多重比对图片可以很直观得到3端序列为CTTGGAGT(C/T/G)AA(G/A)AACATGTG，查询简并碱基代码表（下图），可知C/T/G=B，G/A=R，简并度=3 ×2 =6，整理后3′端序列为 CTTGGAGTBAARAACATGTG，故而需要合成的3′端引物序列： CACATGTTYTTVACTCCAAG （与原序列是反向互补关系）。;3. 质量评估;（3）BLAST 比对回检;（4）两引物互补性检查;接着，在“Primer”-“Two primers Complementarity”-“Second Primer From Input”，粘贴入另一端序列，这里为3端引物序列：CACATGTTYTTVACTCCAAG，如下图：;结果显示，两引物间仅有3 个碱基互补，且自由能仅为1.8 Kcal/mol。;（5）实验验证;M.DNA 分子量标准（100bp）；泳道1-5：PVY 的不同株系（C、O、N、NTN、N-Wi）；泳道6-7：阴性对照（健康马铃薯）和空白对照；泳道8-12：PVX、PVM、PVA、PVS、PLRV;九、延伸阅读