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步骤一：目的基因的提取 3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 利用PCR技术扩增目的基因 变性 退火 延伸 ①概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 ③条件：__________________、 ___________、___________ (做启动子)、 ___________. ②原理:_________ ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 已知基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 利用PCR技术扩增目的基因 ⑥过程： a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________ b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 PCR技术 DNA复制 相同点 原理 DNA复制(碱基互补配对) 原料 四种游离的脱氧核苷酸 条件 模板、ATP、酶、原料、引物 不同点 解旋 方式 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 场所 体外复制(PCR扩增仪) 主要在细胞核内 酶 热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 细胞内含有的DNA聚合酶 结果 在短时间内形成大量的DNA片段 形成整个DNA分子 2.基本操作程序 (1)目的基因的获取 ③PCR扩增技术与DNA复制的比较 ①基因表达载体的组成:启动子、目的基因、终止子以及标记基因等。 2.基本操作程序 (2)基因表达载体的构建(形成重组DNA)——最核心步骤 启动子：位于基因首端，RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA。 终止子：位于基因尾端，使转录在所需要的地方停下来。 目的基因 标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因。 细胞 类型 常用 方法 受体 细胞 转化过程 植物 细胞 农杆菌 转化法 体细胞 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转 入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上 动物 细胞 显微注 射技术 受精卵 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵→获得受精卵→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物 微生 物细 胞 Ca2+处 理增大 细胞壁 通透性 原核 细胞 或酵 母菌 用Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收 (3)将目的基因导入受体细胞-----转化 (4)目的基因的检测和表达 导入检测:检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因。方法：DNA分子杂交 表达检测:①转录检测：目的基因是否转录出了mRNA。 方法：DNA分子杂交。即目的基因作探针与mRNA杂交 ②翻译检测：检测目的基因是否翻译成蛋白质。 方法：抗原——抗体杂交法 个体生物学水平鉴定:对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验。 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 优点 缺点 直接分离法 反转录法 根据已知氨基酸合成DNA法 操作简便广泛使用 工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因（适用原核细胞的基因） 专一性强 操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高（真核细胞的基因 专一性最强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因(真核细胞的基因 步骤二：目的基因与运载体重组 1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出粘性末端。 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的粘性末端。 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 步骤三：目的基因导入受体细胞 1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。 2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。 步骤三：目的基因导