第三章克隆载体特征和类型.pptVIP

第三章 基因克隆的载体 载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 野生型入噬菌体DNA为双链线性分子 黏性末端(cohesive end)：线性分子左右两端各有12bp组成的5端突出的粘性末端，?DNA进入宿主细胞后黏性末端连接形成环DNA分子。 cos位点(cohesive end site) ：指在连接酶的作用下，连接上述黏性末端结合形成的双链DNA区段。又称黏性末端位点。 l噬菌体DNA分子上有56种限制性核酸内切酶识别位点。 温和噬菌体，易于在溶源生长保存，在溶菌生长增殖。 C 用于基因转移的受体菌或细胞 考斯质粒与噬菌粒 考斯质粒（cosmid） 考斯质粒载体的特点： 能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便，筛选容易 不能体内包装，不裂解受体细胞 考斯质粒与噬菌粒 噬菌粒（phagemid or phasmid） 噬菌粒载体的特点： 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子 以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体 能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb） 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便，筛选容易 通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA 考斯质粒与噬菌粒 噬菌粒（phagemid or phasmid） 重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119 pUC118 pUC18 + M13间隔区 IG pUC119 pUC19 + M13间隔区 IG 500 个拷贝 3200 bp MCS lacZ’ lacI ori Apr M13-MG pUC118 / 119 表示M13辅助噬菌体DNA 考斯质粒与噬菌粒 噬菌粒（phagemid or phasmid） 重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体 pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7 2958 bp MCS lacZ’ PT7 ori Apr f1-ori pBluescript PT3 噬菌体启动子PT3和PT7强化外 源基因的转录 提取出来的单链DNA重组分子 在噬菌体RNA聚合酶的存 在下，又可实现外源基因 的体外转录 人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百 甚至上千 kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载 量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳 定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外 源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体， 它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人造染色体（BAC） 酵母人造染色体（YAC） 人造染色体载体 细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上 构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间 各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 人造染色体载体 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为350 - 400 kb 人造染色体载体 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） 酵母人造染色体的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TEL BamHI TEL ori Apr TRP ARS EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 连接 转化酵母菌 重组酵母染色体 3 基因工程的基本条件 各种基因工程受体的特性 实验室常用的基因工程受体 受体细胞应具备的条件 受体细胞应具备的条件 限制性缺陷型 外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 重组整合缺陷型 用于