槲皮素,铜离子对葡萄糖苷酶的抑制作用.docVIP

槲皮素，铜离子对?-葡萄糖苷酶的抑制作用研究 一、实验原理 ?-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)是一类能够从含有?-葡萄糖苷键底物的非还原端催化水解?-葡萄糖基的酶的总称，包括麦芽糖酶、异麦芽糖酶、蔗糖酶等，又叫?-D-葡萄糖苷水解酶。位于小肠绒毛粘膜细胞刷状缘的?-葡萄糖苷酶在机体的代谢过程中起着十分关键的作用，参与了人体对摄入的淀粉和蔗糖等碳水化合物的消化吸收、糖蛋白和糖脂的加工，与许多因代谢紊乱失调而引起的疾病、神经细胞的分化、肿瘤的转移以及病毒和细菌的感染有密切关系。因此，通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以达到治疗某些疾病的目的，研究最为成熟的是治疗Ⅱ型糖尿病的口服降糖药物。其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。 虽然苯并咪唑衍生物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性鲜有报道，但α-葡萄糖苷酶抑制剂的种类繁多，如多糖类（包括多糖、纤维素、果胶、寡糖等）、黄酮类、生物碱类、皂苷类等。应用于临床的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要是：阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇（图1）。当前，为了寻找抑制活性更强、副作用更低以及合成步骤更简单的α-葡萄糖苷酶抑制剂，国内外仍不断地致力于开发新型的α-葡萄糖苷酶抑制剂。 图1阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇的结构式 二、实验材料与方法 1. 实验试剂 酵母?-葡萄糖苷酶、 对硝基苯酚葡萄糖苷(pNPG)、 金属离子和糖类、 槲皮素(HPLC分析测试纯的大于98%)、 缓冲溶液0.0 （1）槲皮素溶液的配制：称取3.02mg槲皮素溶解于10ml DMSO中，配成1μmol/ml。 （2）硫酸铜溶液的配制：称取2.50mg五水硫酸铜溶解于10ml蒸馏水中，配成1μmol/ml。 （3）?-葡萄糖苷酶溶液的配制：称取2mg酶，溶解在1ml缓冲液中。 （4）底物的配制：称取对硝基苯酚葡萄糖糖苷（pNPG）15mg，溶液在15ml蒸馏水中。 2.实验仪器 岛津UV-2501PC、 江苏海门市麒麟医用仪器厂QL-901型漩涡混合器、 石英比色皿(光径1cm)、可调试移液器、 瑞士Gunt W28恒温水浴锅、 CvberScan pH510型电子数显pH计。 3. 实验方法 （1）??葡萄糖苷酶抑制活性的半抑制浓度IC50测定方法 在1.5mL的离心管中加入50μl一定浓度的样品溶液（DMSO溶解）、10μl?-葡萄糖苷酶溶液（1.00mg/mL），磷酸盐缓冲液（0.01mol/L, pH=6.80）880μl，在室温下放置20min后，加入60μl 对硝基苯酚葡萄糖糖苷（pNPG）溶液（1.00mg/mL），迅速混合均匀后测定其在400 nm处吸光度的时间扫描曲线，由其随时间增长而上升的斜率可反映其反应速率。以相同体积的空白DMSO的反应速率为控制速率K0。 不同浓度槲皮素样品的配制： 样品溶液（μl）：5 201510 5 0（空白） DMSO （μl）：0 5 50 与缓冲液、酶液培育20分钟，加底物60μl，混合后400nm测光吸收随时间变化值。 不同浓度铜离子样品配制： 样品溶液（μl）：50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0（空白） 缓冲液 （μl）： 880885 890 895 900 905 910 915 920 925 930 加入酶液10μl）后，培育20分钟，加底物60μl，混合后400nm测光吸收随时间变化值。 （2）??葡萄糖苷酶抑制作用类型动力学的测试方法 采用Lineweaver-Burk作图法判断。反应速率的测量方法同上。固定酶和样品浓度，改变底物浓度，得一系列反应速率值，以1/V对1/[S]作图，即得一条双倒数曲线。保持酶浓度不变，改变样品浓度，以同样方法得到另外几条双倒数曲线。根据双倒数作图可确定其为可逆抑制类型，根据双倒数方程可计算?-葡萄糖苷酶的米氏常数Km和样品对?-葡萄糖苷酶抑制作用的抑制常数Ki。 底物浓度的变化：20μl，25μl，30μl，35μl，40μl，45μl，50μl，55μl，60μl。 建议铜离子浓度：样品固定10μl，20μl。 建议槲皮素浓度：10μl，20μl 三、数据处理 （1）作图法求IC50值 根据实验结果，将没有加入样品时的酶活力定为100%，那么加入不同浓度样品后的酶活力为相对活力百分数(即残余活力百分数) 表1 槲皮素抑制活性结果 槲皮素体积/μL 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 槲皮素浓度/μmol/L 50 45 40 35 30 2