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应用伊文思兰灌注技术观察冰片 对小鼠血脑屏障通透性的影响 实验名称  实 验 目 的 冰片属芳香开窍之品，气味芳香善于走窜，有开窍醒神之效，常用于治疗闭证神昏。本实验应用伊文思蓝(EB)灌注法并结合脑组织EB含量测定,检测冰片对正常小鼠及脑缺血小鼠血脑屏障通透性的影响。 实验原理 血脑屏障由脑微血管内皮细胞、基膜和胶质细胞足突组成,是一个介于血液、脑及脊髓之间的通透性较低的有选择性通过能力的动态界面。生理条件下,血脑屏障在维持脑的内环境及脑与外周信息和物质传递中发挥重要作用。现代药理研究表明，以冰片为代表的开窍药能在一定程度上改 变血脑屏障通透性，从 而迅速进入中枢神经系 统发挥治疗作用。 实验原理 伊文思蓝是一种经典的血脑屏障通透性示踪剂，它与血清蛋白结合形成伊文思蓝白蛋白，不能透过完整的血脑屏障。当血脑屏障通透性增加时．伊文思蓝可随血管内的蛋白成分进入组织间隙。其渗出量与血脑屏障开放程度呈正相关。伊文思蓝灌注后，通过对脑组织中渗入的伊文思蓝含量进行定量分析,则可计算蛋白的渗出量，可作为判断血脑屏障通透性改变的一种定量指标。 实验材料 动物 雄性ICR小鼠，清洁级，体重18g-20g。 试剂 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、TWEEN-20、冰 片、0.9%生理盐水、2.5%伊文思蓝（EB）溶液、3%水合氯醛、50%三氯醋酸、甲酰胺、无水乙醇、蒸馏水。 仪器 电子天平、药匙、量筒、烧杯、磁力搅拌器、移液器、玻璃棒、研钵、灌胃针、注射器、眼科镊、剪刀、止血钳、输液器、平皿、医用托盘、大头针、海绵板、玻璃瓶、1.5mLEP管、水浴箱、离心机、酶标仪、匀浆机。 。 实验内容 ①冰片对正常小鼠脑组织伊文思蓝含量的影响 ②冰片对脑缺血小鼠脑组织伊文思蓝含量的影响 114只 冰片组（4只） 正常组（4只） 脑缺血组（15只） 脑缺血+冰片组（15只） ① ② ①冰片对正常小鼠脑组织伊文思蓝含量的影响 1.冰片组（4只） 2.正常组（4只） 30min 1h后 3%水合氯醛 （0.15ml/10g） 灌胃给药 注意事项： ① 小鼠捉持 以右手提鼠尾，将小鼠放于粗糙面上 （如鼠笼盖网），向后轻拉其尾，可使小鼠抓紧在 粗糙面上。以右手的拇指、食指和中指捏住小鼠两 耳及头部皮肤，无名指、小指和掌心夹住其背部和 尾部，使小鼠腹部向上，颈部拉直但不能过紧以免 窒息。 ② 小鼠灌胃 捉持后使小鼠头部朝上，右手持配有 灌胃针头的注射器，自口角插入口腔，针头紧沿着 上腭进入食道，如插入正确推注药物时容易进入， 若小鼠挣扎，并且推注药物有阻力，可能插入气管， 应退出再插。 眶静脉注射 注意事项： 1、抓紧小鼠，左手拇指和食指抓住鼠两耳 之间的皮肤使鼠固定，并用中指配合，轻轻 压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分 外突，提示眼眶后静脉丛充血。右手持注射 器，将其尖端插入内/外眼角与眼球之间， 轻轻向眼底方向刺入，深度约2—3mm 。2、速度不宜太快，否则一方面赶不上小鼠的 吸收速度容易溢出，另一方面速度太快小鼠 适应不及。基本上在不溢出的前提下，匀速 给药即可。 心内灌注 步骤： 眶静脉注射伊文思蓝1h后，经腹腔注射3%水合氯醛，注射量为0.15mL/10g，待小鼠充分麻醉后用大头针将其固定于海绵板，置于医用托盘上，而后行常规胸腹联合切口，开胸，暴露心脏，将平头针从心尖处插入左心室，用血管钳将心室和平头针一起钳夹固定，用生理盐水进行灌注（低流速），同时迅速在充盈的右心耳处剪开缺口，待流出液由血液变为清亮液体，小鼠肺脏变白或肝脏表面出现较多白色条纹，提示灌注完全。 取脑 用剪刀于头颈联合处剪掉小鼠头部，后用镊子层层剥离脑周组织，逐步掰开颅骨取脑（尽量保持鼠脑完整性），将取下的鼠脑置于干燥平皿中，用剪刀迅速去除小脑，分离左右脑，于电子天平上称量。分别记录各小鼠左右脑重量。 组织处理 甲酰胺浸泡法 45℃水浴孵育24h 10min 三氯醋酸抽提法 匀浆 1